手性农药戊硫吡酰胺对血清白蛋白的对映选择性结合机制：多光谱与计算模拟研究

　　本研究针对手性农药戊硫吡酰胺（penthiopyrad）对映体与血清白蛋白（BSA/HSA）的结合机制不明确的问题，通过光谱学和计算模拟方法，揭示了S-(+)-对映体具有更强的结合亲和力和更高的环境风险。研究结果表明S-(+)-penthiopyrad与BSA/HSA的结合常数（Ka）更高，且通过氢键和疏水作用主要结合在site II（亚结构域IIIA）。该研究为手性农药的安全评价和绿色农用化学品开发提供了重要理论依据。

　　

随着现代农业的发展，手性农药的使用日益广泛，但这些农药的对映体（enantiomers）在生物活性和毒理学特性上往往存在显著差异，可能带来潜在的环境和健康风险。戊硫吡酰胺（penthiopyrad）作为一种新型手性杀菌剂，以外消旋混合物（racemic mixture）形式在全球数十个国家注册使用，用于防治多种蔬菜和作物的真菌病害。然而，过量使用可能导致其在食物链中生物积累（bioaccumulation），对人体健康产生不利影响。戊硫吡酰胺通过抑制真菌线粒体中的琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase）破坏能量代谢，还可能通过产生活性氧物种（reactive oxygen species, ROS）诱导氧化应激（oxidative stress），造成细胞膜、蛋白质和DNA的损伤，甚至引发组织坏死（tissue necrosis）。研究表明，戊硫吡酰胺对水生生物具有高毒性，对斑马鱼胚胎和幼虫的96小时半致死浓度（LC₅₀）分别为2.77 mg/L和2.38 mg/L。因此，从分子水平研究手性戊硫吡酰胺的毒理效应至关重要。

蛋白质是生命体的基本组成部分，不仅构成生物体的结构框架，还调节关键的生理过程（physiological processes）。血清白蛋白（serum albumin）是哺乳动物血液中最丰富的血浆蛋白（plasma protein），能够结合和运输多种内源性及外源性小分子（small molecules）。然而，污染物分子与血清蛋白的相互作用可能干扰正常的生理功能，诱发毒理效应（toxicological effects）。牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）和人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）在结构和配体结合方面具有相似性，常被用作研究农药-蛋白质相互作用的模型蛋白。尽管这两种蛋白结构相似，但它们与相同分子的结合相互作用存在显著差异，通过比较BSA和HSA与同一污染物的结合亲和力，可以揭示蛋白质细微结构变异对结合特性和毒理影响的作用。

为解决上述问题，研究人员在《Advanced Agrochem》上发表了一项研究，通过多种光谱技术、密度泛函理论（density functional theory, DFT）计算和分子对接（molecular docking）模拟，系统研究了R-(?)-和S-(+)-戊硫吡酰胺对映体与BSA/HSA的立体选择性结合机制。

本研究主要采用了荧光淬灭（fluorescence quenching）测量、同步荧光光谱（synchronous fluorescence spectroscopy）、圆二色谱（circular dichroism, CD）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）、三维荧光光谱（three-dimensional fluorescence spectra）、密度泛函理论计算和分子对接模拟等关键技术方法。实验中使用BSA和HSA样本（来源于商业供应商，具体队列未注明），在Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中进行，温度控制在298 K、303 K和308 K。

3.1. 荧光淬灭机制

通过荧光光谱分析，发现随着R-(?)-PEN和S-(+)-PEN浓度的增加，BSA和HSA的荧光强度逐渐降低。Stern-Volmer淬灭常数（K_SV）随温度升高而降低，表明淬灭机制为静态淬灭（static quenching）。淬灭速率常数（k_q）远超过动态淬灭的最大碰撞常数，进一步证实了静态淬灭机制。时间分辨荧光光谱显示，加入对映体后BSA和HSA的平均荧光寿命变化微小，紫外-可见吸收光谱的变化也支持了复合物形成的结论。

3.2. 结合常数与结合位点

利用修饰的Stern-Volmer方程计算结合常数（K_a）和结合位点数（n），发现S-(+)-PEN与BSA和HSA的结合常数均高于R-(?)-PEN，表明S-(+)-对映体具有更强的结合亲和力。结合位点数n≈1，提示对映体与BSA/HSA的单一结合位点相互作用。位点竞争实验表明，对映体主要结合在site II（亚结构域IIIA）。

3.3. 热力学参数

通过van't Hoff方程计算热力学参数，ΔH < 0且ΔS < 0/ΔS > 0，表明结合过程主要由氢键和疏水作用驱动。ΔG < 0说明结合是自发的，且S-(+)-PEN的ΔG更负，表明其结合更稳定。

3.4. 同步荧光光谱

在Δλ = 15 nm和60 nm下的同步荧光光谱显示，对映体对酪氨酸（tyrosine）残基的微环境影响大于对色氨酸（tryptophan）残基，且淬灭效果在Δλ = 15 nm时更为显著，表明对映体与酪氨酸残基有更近的结合亲和力。

3.5. CD和FTIR光谱

CD光谱分析显示，加入对映体后BSA和HSA的α-螺旋含量减少，S-(+)-PEN引起的减少幅度更大。FTIR光谱中酰胺I带和II带的变化表明对映体破坏了蛋白质中羰基氢键网络，导致二级结构改变。

3.6. 三维荧光光谱

三维荧光光谱中峰值强度的降低表明对映体诱导了BSA/HSA局部环境的改变，降低了蛋白质的稳定性和活性。

3.7. DFT计算

DFT计算显示S-(+)-PEN的HOMO-LUMO能隙（ΔE = 4.827 eV）小于R-(?)-PEN（5.189 eV），表明S-(+)-对映体具有更高的反应性和结合亲和力。

3.8. 分子模拟

分子对接结果表明，对映体主要结合在BSA和HSA的site II（亚结构域IIIA），结合能分别为-20.48/-23.92 kJ/mol（R-(?)-PEN）和-25.68/-25.88 kJ/mol（S-(+)-PEN），证实S-(+)-对映体形成更稳定的复合物。疏水表面分析和氢键相互作用揭示了对映体与氨基酸残基（如ARG409、TYR410等）的详细结合模式。

研究结论表明，S-(+)-戊硫吡酰胺对映体与BSA和HSA的结合亲和力更强，主要通过氢键和疏水作用在site II位点结合，诱导蛋白质构象变化，降低α-螺旋含量。DFT和分子对接结果进一步支持了S-(+)-对映体的更高反应性和稳定性。这些发现强调了手性农药对映体在环境行为和毒理效应上的差异，提示在农药安全评价和绿色农用化学品开发中需考虑立体异构体的特异性。该研究为理解手性农药的分子水平相互作用提供了重要见解，对降低其潜在环境和健康风险具有指导意义。