奶牛饲料与水源中革兰氏阴性菌的流行及耐药性：一种健康（One Health）视角下的挑战与启示

　　本综述系统分析了奶牛养殖环境中饲料与水源的微生物污染状况，重点揭示了革兰氏阴性菌（尤其是大肠杆菌Escherichia coli和沙门氏菌Salmonella spp.）的高携带率及其多重耐药性（MDR）特征。研究强调其对“一种健康”（One Health）框架下公共卫生、动物健康与环境安全的交叉威胁，呼吁建立综合性监测体系与抗生素管理（Antimicrobial Stewardship）策略。

　　

1 Introduction

抗菌药物耐药性（AMR）的广泛出现已成为跨越人类医学、动物健康及环境领域的全球性健康威胁。保障动物饲料和饮用水的安全性尤为关键，受污染的来源可能成为耐药病原体的储存库和传播途径，对动物生产、公共卫生和经济产生重大影响。早期断奶等畜牧业常见操作加剧了这一问题的复杂性。

动物饲料及其副产品常受到包括肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、梭菌属（Clostridium spp.）、气单胞菌属（Aeromonas）和弯曲杆菌属（Campylobacter）在内的多种细菌污染，其中沙门氏菌属（Salmonella spp.）的检出率最高。在巴基斯坦等中低收入国家，监管体系薄弱和农场抗生素使用不规范进一步加剧了这一风险。

抗菌药物在治疗人类和动物感染中不可或缺，然而过度或不合理使用扰乱了自然微生物群，推动了多重耐药（MDR）菌株的选择。尽管这些药物在20世纪显著降低了传染病的死亡率，但它们在畜牧业中的广泛使用——尤其是亚治疗剂量——已成为全球耐药性上升的重要因素。近期研究显示，产β-内酰胺酶的大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌在食品生产动物和饲料中的检测频率增加，突显了饲料和水作为耐药性潜在来源和储存库的作用。据预测，抗生素耐药性将成为全球主要死因之一，每年可能导致超过1000万人死亡。

“一种健康”（One Health）框架为应对这一挑战提供了重要视角，强调人类、动物和环境健康之间的相互关联。因此，监测奶牛饲料和水中的耐药性革兰氏阴性菌对于识别污染途径、制定管理策略以及减缓农业系统中AMR的传播至关重要。

2 Materials and methods

2.1 Ethics statement

动物研究遵循中华人民共和国科学技术部发布的《实验室动物护理与使用指南》，所有操作均致力于减少动物痛苦。本研究获国家自然科学基金和中国农业研究系统（CARS-37）资助。

2.2 Sample collection

2.2.1 Feed samples

共采集98份饲料样品，采样过程在无菌条件下进行，得到农场工作人员和农业经销商的协助。根据批次数量按比例选取子样本，每份样品标记后装入无菌袋，运送至实验室分析。

2.2.2 Drinking water samples

49份饮用水样品使用无菌一次性容器从奶牛水槽中无菌采集。样品立即置于含冰袋的保温箱中，4小时内送达实验室进行微生物分析。

2.2.3 Sample size justification

总样本量为160份（饲料98份，水49份），以确保足够的代表性并符合资源可行性，该规模与以往研究保持一致。

2.3 Screening and isolation of microorganisms

采用标准微生物学流程分离沙门氏菌属和大肠杆菌。初步接种于营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝（EMB）琼脂、沙门氏菌-志贺氏菌（SS）琼脂、甘露醇盐琼脂和血琼脂平板，于37°C有氧条件下培养24小时。通过菌落形态、革兰染色和运动性（悬滴法）进行初步鉴定。

2.3.1 Primary isolation and culture

拭子样品分别接种于上述培养基，在37°C有氧和厌氧条件下培养24小时。记录菌落特征，制备革兰染色涂片用于初步鉴定。

2.3.2 Sub-culturing and identification

可疑菌落通过反复传代纯化，纯化分离株通过菌落形态、革兰反应、生化试验（过氧化氢酶、氧化酶、吲哚、凝固酶、三糖铁、西蒙氏柠檬酸盐）以及分析剖面指数（API）进一步确认。大肠杆菌的鉴定依据EMB琼脂上的绿色金属光泽或麦康凯琼脂上的粉红色菌落，沙门氏菌则依据SS琼脂上的无色透明菌落，均通过API和生化试验确认。

2.4 Microscopic analysis

2.4.1 Motility test (hanging drop method)

使用悬滴技术于显微镜下观察各样品分离菌株的运动性。

2.4.2 Gram's staining

革兰染色遵循美国微生物学会（ASM）推荐的标准流程。

2.5 Biochemical tests

2.5.1 IMViC test

IMViC试验用于肠杆菌科的鉴定和区分，具体包括：

2.5.1.1 Indole test

将纯菌培养物接种于色氨酸肉汤，37°C培养24小时后加入柯瓦克试剂，出现樱桃红色环为阳性。

2.5.1.2 Methyl-Red test

接种于MR-VP肉汤，培养后加入甲基红指示剂，红色表示阳性（pH<4.4），黄色或橙色为阴性。

2.5.1.3 VP test

使用VP肉汤培养后加入巴雷特试剂，出现红色或粉红色为阳性，表明乙酰甲基甲醇（乙酰丁香）产生。

2.5.1.4 Citrate test

接种于西蒙氏柠檬酸盐琼脂斜面，培养后培养基由绿变蓝表示阳性，即能利用柠檬酸盐作为唯一碳源。

2.6 Antibiotic susceptibility test

采用CLSI推荐的改良Kirby-Bauer纸片扩散法，使用Mueller-Hinton琼脂进行药敏试验。测试的十种抗菌药物包括：氨苄西林（AMC）10 μg、阿莫西林克拉维酸（AUG）30 μg、头孢噻肟（CTX）30 μg、头孢泊肟（CP）10 μg、头孢他啶（CAZ）30 μg、阿莫西林（AMX）25 μg、头孢呋辛（CXM）30 μg、环丙沙星（CPX）10 μg、四环素（TE）30 μg和链霉素（STR）10 μg。采用双纸片协同试验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBL）产生。

2.7 Multiple Antibiotic Resistance Index (MARI) determination

多重抗生素耐药指数（MARI）计算公式为：MARI = a/b，其中a为菌株耐药抗生素数量，b为测试抗生素总数（此处为10）。MARI值>0.2表明该分离株可能来源于高抗生素使用环境，具有多重耐药特征。

2.8 Statistical analysis

使用Microsoft Office Excel 2007生成图表并进行描述性统计分析，包括均值、标准差、频率和百分比计算。数据经正态分布检验后选用适当方法进行显著性分析，均值用于MARI评分计算。

3 Results

3.1 Confirmation of bacterial isolates

共分析160份样品，其中饲料n=98，饮用水n=49。71份样品（44.3%）沙门氏菌属阳性，79份（49.3%）大肠杆菌阳性，显示多处采样点存在显著污染，大肠杆菌为最常检出微生物。牛和水牛饲料及水样品污染水平最高，绵羊和山羊样品最低。不同农场间沙门氏菌分离率的差异具有统计学意义。

3.2 Streak plate method

菌落形态观察显示样品中仅存在单一细菌类型，部分平板可见色素形成。

3.2.1 Microscopic analysis

3.2.1.1 Motility test

运动性试验显示所选菌株均具运动能力，且所有运动菌均为杆状。经芽孢染色，于10X和100X放大下，大肠杆菌和沙门氏菌呈粉红色杆状细胞，未见绿色芽孢结构，证实为革兰阴性非芽孢杆菌。

3.3 IMViC test results

IMViC生化试验结果总结显示，该系列试验是基于生化特性鉴定和区分肠杆菌科细菌的可靠方法。所有测试菌株均可产生吲哚（吲哚试验阳性）；甲基红试验中红色出现表明可进行葡萄糖混合酸发酵；VP试验中无红色或粉红色出现，表明无乙酰甲基甲醇产生； citrate试验中颜色变化则区分了菌株的柠檬酸盐利用能力。

3.3.1 Indole test

阳性对照（大肠杆菌）出现樱桃红色环，阴性对照（枯草芽孢杆菌）无颜色变化，测试样品液面出现粉红至红色层，表明所有菌株均可产生吲哚。

3.3.2 Methyl Red test (MR)

培养后加入甲基红指示剂，红色表示阳性（pH<4.4），黄色或橙色为阴性。

3.3.3 Voges-Proskauer test

加入巴雷特试剂后无特征性红色或粉红色出现，表明所有测试分离株均为VP阴性。

3.3.4 Citrate utilization test

接种于西蒙氏柠檬酸盐琼脂，培养后颜色由绿变蓝为阳性，反之为阴性。

3.4 Antimicrobial susceptibility of the bacterial isolates

药敏分析显示抗生素对革兰阳性菌和阴性菌普遍有效，但饮用水和动物饲料中分离的环境大肠杆菌和沙门氏菌属均呈现耐药性。菌株对十种抗生素均存在耐药情况，显示污染广泛且耐药谱多样。总体而言，大肠杆菌检出频率最高，沙门氏菌属则表现出相对较高的抗生素敏感性。

3.5 Resistance rates and Multiple Antibiotic Resistance Index (MARI) of bacterial isolates

通过抑菌圈直径测量评估菌株对10种抗生素的敏感性。大肠杆菌对6种抗生素耐药，沙门氏菌属对4种耐药。两菌种对氨苄西林、头孢泊肟、头孢噻肟、环丙沙星、阿莫西林克拉维酸和链霉素高度敏感。

MARI分析显示，大肠杆菌分离株的MARI较高（0.6），表明其来源于高抗生素使用环境并具多重耐药潜力；沙门氏菌属MARI为0.4，呈中等耐药。抑菌圈直径均值±标准差显示，大肠杆菌耐药水平略高于沙门氏菌属，但差异微小，突显了采样饲料和水源中多重耐药菌的存在。

4 Discussion

尽管动物福利研究广泛关注奶牛，早期断奶等问题仍然存在。本研究分析了水和动物饲料样品中沙门氏菌属和大肠杆菌的流行及其多重耐药（MDR）模式。大肠杆菌为最常分离菌种（51.7%），沙门氏菌属次之（46.3%），与以往 livestock 和饲料研究报告一致。

研究发现大肠杆菌和沙门氏菌均对多种β-内酰胺类抗生素耐药，对环丙沙星、四环素、头孢克肟和头孢呋辛呈中等耐药，与巴基斯坦及邻国研究相符，表明畜牧业环境中MDR病原菌广泛存在。

通过系列生化试验表征菌株特性，悬滴技术用于观察运动性及细胞形态排列。IMViC试验有效区分大肠杆菌（通常吲哚阳性、甲基红阳性、柠檬酸盐阴性）和沙门氏菌（吲哚阴性、甲基红阳性、柠檬酸盐阳性），其中柠檬酸盐利用差异尤为关键。VP试验检测葡萄糖发酵中乙酰甲基甲醇的产生，本研究所有菌株均为VP阴性。

药敏试验中，大肠杆菌对氨苄西林、头孢泊肟、头孢噻肟和环丙沙星的敏感性最高（25%和19%），其次为链霉素和阿莫西林克拉维酸（24%和18.4%），与动物源菌株耐药性快速上升的报道一致。沙门氏菌属中阿莫西林耐药率高达50%，与埃塞俄比亚等国先前研究吻合。

动物饲料和饮用水检出菌量最高，该类饲料通常直接消费但生产监管较弱，很少采用高温处理。生产线清洁不足、啮齿动物控制不力、储存不当及包装条件差可能是污染的主要原因。

菌株MARI值范围0.06–0.07，表明中度抗生素暴露，与此前夸大数值形成对比。即便该水平的高MARI值也显示农场抗生素使用持续产生选择压力，并强调饲料和水传播MDR的风险。平均MARI值0.8高于加纳（0.11–0.78）和南非（0.3–0.6）的报告，进一步表明采样农场抗生素滥用严重，对动物健康构成威胁，并具显著的一种健康意义。

污染可能源于生产、储存和处理过程中卫生条件不足，与先前报告一致。这些发现强调了严格生物安全措施、适当饲料管理和抗生素使用监测对遏制耐药菌传播的重要性。

与全球监测计划（如WHO和国家监控系统）比较显示，食品生产动物来源的大肠杆菌和沙门氏菌分离株存在类似耐药趋势，突显了抗菌药物耐药性在一种健康框架下的传播风险。

尽管样本量充足，阳性样本数有限制了进一步统计分析。未来研究应包含耐药基因的分子表征，以深入理解畜牧业环境中MDR的形成机制。

5 One Health integration

本研究通过抗菌药物耐药性（AMR）视角揭示了动物、环境与人类健康间的内在联系。耐药性大肠杆菌和沙门氏菌存在于动物饲料和水中，不仅影响牲畜健康，亦对人类构成风险——特别是直接接触这些细菌的农场工作者。此外，食用受污染的乳制品可能成为向消费者传播耐药病原体的直接途径，形成重大公共卫生问题。

为应对这些挑战，我们提出一种健康监测模型，包括定期监测牲畜健康与细菌耐药谱、环境样本（如土壤和径流水）以探测污染源，以及在伦理允许条件下筛查人类操作者的耐药菌定植或感染。这一综合策略有助于早期检测、改善风险评估，并为控制该地区AMR传播的协同干预提供依据。

6 Significance and future directions

本研究强调了奶牛动物饲料和水中多重耐药大肠杆菌和沙门氏菌的高流行，迫切需采取针对性措施减少畜牧业中的抗菌药物误用。未来工作应包括这些分离株的分子表征，如检测和测序特定耐药基因，以更好理解遗传决定因素及水平基因转移潜力。纵向研究对监测耐药趋势和评估干预策略效果至关重要。将监测范围扩展至环境来源（土壤、粪便和农场径流）将提供更全面的AMR传播图景。这些发现还具有重要政策意义，可支持制定农场级AMR监测计划和加强抗菌药物管理框架，以与国家及全球一种健康倡议相接轨。

7 Conclusion

奶牛动物饲料和水中抗菌药物耐药性革兰氏阴性菌的高流行对动物和公众健康均构成严重威胁。这一耐药性可能由卫生条件差、抗生素过度使用和环境污染等因素驱动。多重耐药菌株的检测突显了亟需严格规范畜牧业抗生素使用。应对这一挑战，需实施定期监测、改善卫生条件、抗菌药物管理计划及抗生素的可持续替代方案。加强政策与兽医诊断能力，以及提高公众对合理使用抗生素的认识，是减少抗菌药物耐药性的关键步骤。未来研究应聚焦于理解耐药机制并制定有效控制策略。立即采取行动对保障动物福利和阻止抗菌药物耐药性蔓延至关重要。