羊驼自然感染结核病肉芽肿的组织学与免疫组化特征及其传播风险研究

　　本文首次系统描述了自然感染结核分枝杆菌复合体（MTBC）的羊驼体内结核性肉芽肿的组织病理学与免疫组化特征，揭示了羊驼作为潜在传染源的高风险性。研究通过分析肺、肝和淋巴结中不同发展阶段（I–IV期）的肉芽肿结构、细胞组成及抗酸杆菌（AFBs）分布，发现晚期肉芽肿占主导且肺部AFBs载量极高，提示免疫控制缺陷与显著传播风险，为骆驼科动物结核病防控及人兽共患病管理提供关键科学依据。

　　

1 引言

结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌复合体（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）引起的慢性人兽共患病，对高度易感的羊驼（Vicugna pacos）构成严重威胁。随着欧洲羊驼种群扩大及其与人类密切接触的增加，理解该物种中结核病的病理表现至关重要。本研究首次对自然感染MTBC的羊驼结核性病变进行了全面的组织病理学和免疫组化表征，旨在阐明肉芽肿发育的细胞动力学及其与疾病传播风险的关系。

2 材料与方法

2.1 案例背景

研究农场位于英国牛津郡，初始畜群规模约700只羊驼。2019年1月首例临床病例出现于租赁牧场，表现为肺炎症状，尸检发现肺、肝、脾及多处淋巴结存在结核样病变。随后疫情扩散，累计对233只羊驼进行尸检，采集病变组织固定于10%中性缓冲福尔马林（NBF）并进一步处理。

2.2 细菌学与病原检测

初始病例样本培养MTBC阳性，另一病例鉴定为M. bovis。皮肤试验阳性个体中部分为非结核分枝杆菌（如M. vaccae、M. terrae）感染。PCR检测首例样本为MTBC阳性，但未能完成菌种分型。

2.3 组织病理学分析

选取肺（n=12）、肝（n=40）及淋巴结（n=10）具结核样病变的样本，经石蜡包埋后制备4 μm切片，行苏木精-伊红（H&E）染色。数字化切片扫描后，采用Ziehl-Neelsen（ZN）染色检测抗酸杆菌（AFBs），并按数量分级评分：0=无；1=1–10；2=11–50；3=≥50。另对化脓性肉芽肿病变行Gram染色排除非分枝杆菌感染。

2.4 免疫组化研究

基于H&E染色结果，选取12例肺和22例肝样本的代表性肉芽肿，应用抗体标记巨噬细胞（IBA1⁺）、中性粒细胞（髓过氧化物酶MPO⁺）、B细胞（B细胞特异性激活蛋白SAP⁺）及T细胞（CD3⁺）。纤维组织通过波形蛋白（vimentin）抗体标识。数字化图像分析采用NIS-Elements软件，计算免疫标记面积占比。

2.5 统计分析

使用GraphPad Prism进行非参数ANOVA（Kruskall-Wallis）及多重比较检验，以p<0.05为显著性阈值。

3 结果

3.1 肉芽肿分期（I–IV期）

根据大小、细胞组成、坏死程度、纤维化及AFBs存在情况，将肉芽肿分为4期：

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  I期：小型无包膜结构，以巨噬细胞簇为主，伴少量淋巴细胞，偶见泡沫细胞和中性粒细胞，多核巨细胞（MNGCs）罕见。

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  II期：较大、界限清晰、圆形，含上皮样巨噬细胞、淋巴细胞、泡沫细胞和中性粒细胞，中心可见微小坏死区。

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  III期：中央坏死伴中性粒细胞退化及早期干酪样坏死，外围环绕上皮样巨噬细胞，极少MNGCs，外层见淋巴细胞、浆细胞及中性粒细胞。

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  IV期：形态不规则，具广泛干酪样坏死和矿化，部分包以厚纤维囊（尤其肝脏），坏死周见上皮样巨噬细胞及外周淋巴细胞聚集。

肝内肉芽肿常整合Glisson囊原有结缔组织，波形蛋白染色证实纤维囊存在。Gram染色未发现非分枝杆菌。

3.2 肉芽肿发育与AFBs分布的器官比较

晚期肉芽肿（III–IV期）在所有组织中占主导。肺和淋巴结中AFBs数量随病变进展增加，IV期多数含>50个AFBs；肝脏则相反，早期肉芽肿AFBs更多，晚期因纤维包裹而减少。淋巴结仅见晚期肉芽肿且均检出AFBs。

3.3 肉芽肿内细胞种群分布

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  巨噬细胞（IBA1⁺）：所有阶段最主要细胞，阳性率随进展下降（肺中显著降低）。分布于整个病变，早期弥漫，晚期环绕坏死核心。

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  T细胞（CD3⁺）：早期弥漫分布，晚期聚集于肉芽肿外围。肝脏中晚期显著增加（vs早期p<0.0001），肺中整体较低且阶段间无显著差异。

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  B细胞（SAP⁺）：分布类似T细胞，但阳性率较低。晚期肝肉芽肿见类淋巴滤泡结构，B细胞数量显著高于早期。

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  中性粒细胞（MPO⁺）：数量最少但随进展增加，晚期肺中显著增多（p<0.01），分布于坏死区及病变周边。

4 讨论

本研究首次系统描述了羊驼自然感染MTBC后肉芽肿的发育阶段及细胞组成。与牛、野猪等物种相比，羊驼肉芽肿中MNGCs极少，但晚期病变中AFBs载量极高（尤其肺和淋巴结），提示免疫控制失效及高传播风险。肝脏病变高发表明病原广泛播散，但纤维包裹及AFBs减少反映其较强控制能力，可能与肝脏特有 phagocyte 限制性感染机制有关。

免疫组化揭示巨噬细胞主导早期反应，T/B细胞在晚期形成结构化淋巴细胞聚集，中性粒细胞参与坏死调节。这些发现凸显羊驼作为MTBC储存宿主及人兽共患病源的风险。

5 结论

本研究填补了骆驼科动物结核病病理学的知识空白，证实羊驼结核性肉芽肿具有高AFBs负荷及晚期病变主导的特征，强调其作为家畜、野生动物及人类感染源的潜在威胁。肝脏病变普遍性提示疾病常呈全身化，而肺与淋巴结的高菌量预示显著传播风险。