REDD1通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路减轻胆汁淤积性肝纤维化的机制研究

　　本研究揭示了REDD1在胆汁淤积性肝纤维化中的关键保护作用，通过RNA测序和临床样本验证发现REDD1表达与纤维化程度呈正相关。机制研究表明，REDD1过表达可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活化，显著改善胆管结扎（BDL）模型小鼠的肝功能指标（ALT/AST），减少胶原沉积和肝星状细胞活化标志物（α-SMA/Collagen I）表达，为临床抗肝纤维化治疗提供了新的潜在靶点。

　　

引言

肝纤维化作为可逆性病理过程，在慢性肝病发展中具有重要意义。胆汁淤积是导致肝纤维化的重要因素，其中原发性胆汁性胆管炎（PBC）作为一种以进行性胆汁淤积为特征的自身免疫性肝病，在肝病中发病率较高，可导致肝功能进行性丧失、肝纤维化及后续肝硬化甚至肝细胞癌（HCC）的发生。由于肝纤维化的可逆性特性，如何抑制甚至逆转肝纤维化已成为当前研究的热点。肝星状细胞（HSCs）活化在肝纤维化发展中起着关键作用，活化的HSCs是细胞外基质（ECM）的主要来源，包括纤维形成型I型胶原，这些物质扰乱正常肝功能和结构。尽管熊去氧胆酸（UDCA）已广泛应用于PBC和胆汁淤积性肝病的临床治疗，但它不能通过减少HSCs活化发挥抗纤维化作用。目前临床上尚无有效药物能够抑制HSCs活化和减轻肝纤维化。

REDD1（发育和DNA损伤反应调节因子1），也称为Ddit4（DNA损伤诱导转录本4），是一种营养/能量传感器和早期应激反应基因，可被缺氧、生长因子耗竭、DNA损伤以及糖皮质激素激活。REDD1作为应激激活基因，调节多种细胞活动，如代谢、氧化应激、自噬和细胞命运，在代谢性和炎症性疾病、神经退行性疾病和癌症发展中发挥作用。关于REDD1在治疗肝病中的作用目前存在多种理论：有研究表明REDD1缺失可预防非酒精性脂肪肝病；相反，REDD1过表达通过抑制TGFβ/Smad信号通路减弱HSCs活化和CCL4诱导的肝纤维化。然而，REDD1在胆汁淤积性肝纤维化中的作用目前尚不清楚。

材料与方法

本研究通过山西医科大学动物伦理委员会审查批准。采用雄性C57BL/6小鼠，通过胆总管结扎术（BDL）诱导胆汁淤积性肝纤维化模型，手术4周后获取肝组织。通过尾静脉注射腺病毒介导的REDD1（Ad-REDD1）进行干预治疗。

临床样本包括来自健康肝移植供体的10例正常肝组织作为对照，以及来自北京友谊医院经病理检查确诊的20例PBC患者肝组织。所有研究程序遵循伦理标准，并获得首都医科大学北京友谊医院医学伦理委员会批准。

RNA测序分析中，每组随机选择3个样本（对照组：C1、C2、C3；实验组：B1、B2、B3），按照制造商方案取出肝组织送至广州基迪奥生物科技有限公司进行RNA提取、质量检测、文库制备和质量检查，最后进行RNA测序和分析。为确保测序质量，采用严格质量控制标准：琼脂糖凝胶电泳分析样本RNA完整性和DNA污染情况；NanoPhotometer分光光度计检测RNA纯度；Qubit2.0荧光计精确定量RNA浓度；Agilent 2100生物分析仪准确检测RNA完整性。读段过滤步骤包括：去除含有接头的读段；去除N≥10%的读段；去除全部为A碱基的读段；去除低质量读段（超过50%的读段碱基质量值Q≤20）。使用Illumina测序平台进行测序。

差异表达基因（DEGs）分析使用DESeq R包进行，筛选条件为FDR<0.05且|log2FC|>1的基因为显著差异基因。通过GOseq R包和KOBAS软件进行DEGs的GO富集分析和KEGG通路分析，超几何分布p<0.05被认为是显著富集。

组织学分析包括H&E染色、天狼星红染色和Masson染色。H&E染色使用苏木精和伊红（HE）染色试剂盒按标准方案进行；天狼星红染色将肝组织切片脱蜡水化后，用天狼星红溶液染色30-60分钟（根据胶原含量调整），冲洗掉多余染料后通过一系列乙醇浓度脱水并在二甲苯中透明，最后用中性树脂封片观察；Masson染色使用Masson染色试剂盒进行，主要使用苏木精、伊红和苯胺蓝等染料选择性染色不同组织成分，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。

血清ALT和AST检测通过ELISA法测定小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。

基因验证采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR），使用TRIzol溶液从肝组织中提取mRNA，按照制造商说明进行，随后测量mRNA浓度和纯度。使用cDNA逆转录试剂盒和miScript SYBR Green PCR试剂盒进行mRNA的逆转录和定量实时PCR。以GAPDH为内参计算mRNA表达水平，所需引物由上海生工生物科技有限公司设计合成。

免疫组化（IHC）分析中，石蜡包埋肝组织切片经二甲苯脱蜡后，用梯度乙醇水化。抗原修复后，切片与以下一抗在4°C下孵育过夜：抗REDD1、抗CD68、抗α-SMA、抗p-PI3K、抗p-AKT、抗mTOR。然后样品在室温下与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育2小时。最后切片用DAB染色、复染、脱水和封片。阳性判断标准为细胞质或细胞核染成棕色颗粒，后续定量分析采用盲法。

统计分析使用SPSS 23.0统计软件和GraphPad Prism 8.0进行分析。所有数据表示为平均值±标准差（SD）。两组间比较，正态分布使用t检验，非正态分布使用Mann-Whitney U检验或Wilcoxon秩和检验；三组及以上比较，正态分布数据采用单因素方差分析 followed by Tukey检验，非正态分布数据采用Kruskal-Wallis检验 followed by Dunn's事后检验。计算Pearson或Spearman相关系数评估生物标志物与REDD1之间的关系。p值<0.05显示有统计学显著差异。

结果

BDL诱导纤维化肝组织的mRNA测序

为验证胆汁淤积性肝纤维化模型成功建立，进行了肝脏大体观和H&E染色。结果显示，与对照组相比，BDL组肝组织颜色变黄，质地变硬，边缘变钝，同时胆囊胆汁淤积，逐渐增多。BDL肝组织H&E染色显示病变主要集中在小叶间胆管周围，表现为炎症细胞浸润、小叶中央坏死增加、小胆管增生扩张、管腔增大和胶原纤维形成。同样，纤维化标志物（包括α-SMA和胶原蛋白I）的免疫组化分析显示，与对照组相比，BDL组α-SMA和胶原蛋白I表达显著增加，证实肝纤维化模型成功建立。

为进一步研究胆汁淤积性肝纤维化的分子机制，进行了RNA测序以检测有无BDL的转录组差异，每个样本三次重复。根据可定位在基因组上的总比对读段的比较结果，计算了读段在参考基因组中的分布位置，超过88%的清洁读段可比对到外显子区域。获得FPKM值后，通过表达分布图显示对照组和BDL组之间基因表达分布的差异。为识别调整后p<0.05的DEGs，采用DESeq R包。从对照组和BDL组共获得3,224个DEGs，其中2,852个基因在BDL组上调，372个基因下调。

BDL诱导肝组织中REDD1的筛选和验证

为说明BDL诱导肝纤维化基因表达的功能变化，对来自三个文库的3,224个DEGs进行了GO富集分析。总共总结了58个富集的GO术语（p<0.05），生物过程28个类别，细胞成分17个类别，分子功能13个类别。在生物过程类别中，显著富集包括细胞过程、生物调节、生物过程调节、对刺激的反应、代谢过程。其中，细胞过程是最富集的，有2,253个基因上调和270个基因下调。为进一步研究DEGs可能参与的信号通路，进行了KEGG通路富集分析。总共注释了340条通路，前20条通路主要集中在五个类别，包括代谢、环境信息处理、细胞过程、有机体系统、人类疾病。KEGG分析了多种分子通路，如信号转导相关通路，包括MAPK信号通路、PI3K/AKT信号通路、Ras信号通路、TNF信号通路、TGF-β信号通路。传染病相关通路，包括利什曼病、阿米巴病、结核病。癌症相关通路，包括癌症中的通路、癌症中的蛋白聚糖、化学致癌作用。在前20条通路中，上调和下调基因都富集在癌症中的通路和PI3K/AKT信号通路。

根据调整后P<0.05和log2FC>1标准，获得了2,852个上调的DEGs。基于先前研究发现自噬参与肝纤维化的发展和进展，进一步基于自噬通路PI3K/AKT筛选，共识别出127个DEGs。接下来，基于P值和表达差异倍数的综合评估，确定了7个DEGs，包括SGK1（血清和糖皮质激素调节激酶1）、REDD1、NGF（神经生长因子）、Col1α2、Col1α1、IGHA（免疫球蛋白重链α链）和Spp1（分泌磷蛋白1）。为验证RNA测序数据中7个DEGs的表达，进行了RT-qPCR分析，观察到REDD1在BDL组中最显著上调。为理解REDD1在人类PBC中的作用，检测了诊断为PBC的患者肝组织切片中REDD1的表达。结果显示，正常肝组织中几乎无阳性细胞，正常肝组织图像中的棕色染色是非特异性染色，而REDD1阳性细胞出现在PBC肝组织中，呈棕色，主要集中在胆管。

REDD1与肝纤维化相关

为确定REDD1是否与PBC患者的纤维化相关，对PBC肝切片进行了CD68和α-SMA的免疫组化染色。CD68通常被认为是泛巨噬细胞标志物，可反映肝纤维化的严重程度。结果显示，CD68表达在对照组中较低，但在PBC患者中较高。此外，α-SMA表达在PBC患者中显著增加。为探索REDD1与CD68或α-SMA之间的表达相关性，进行了相关性分析。结果显示，两者都与REDD1呈正相关，表明REDD1可能调节PBC患者纤维化的发展。

REDD1可能与肝纤维化中的PI3K/AKT/mTOR通路相关

越来越多的研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活促进HSCs活化和肝纤维化。为验证PI3K/AKT/mTOR在PBC患者中的参与，测定了PI3K/AKT/mTOR活性。结果显示，与正常组相比，PBC患者中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白表达增加，表明PI3K/AKT/mTOR可能在临床胆汁淤积性肝纤维化中被激活。为进一步研究REDD1是否与PI3K/AKT/mTOR通路相关，进行了相关性分析。如预期，REDD1与p-PI3K、p-AKT、p-mTOR有显著相关性，证明REDD1可能通过PI3K/AKT/mTOR通路参与肝纤维化的进展。

REDD1改善BDL诱导的肝损伤并降低肝纤维化指标

为进一步评估REDD1的治疗潜力，用腺病毒介导的REDD1（Ad-REDD1）处理BDL诱导的肝纤维化小鼠模型。与未处理的对照组相比，REDD1显著降低了BDL诱导的纤维化小鼠血清ALT和AST水平，表明肝损伤改善。H&E染色、天狼星红染色和Masson染色的代表性图像显示，与未处理的对照组相比，Ad-REDD1处理的小鼠炎症细胞浸润减少、胆管扩张减弱、胶原纤维减少。定量分析进一步证实Ad-REDD1处理显著减少了胶原沉积，表现为天狼星红和Masson染色强度降低。总之，REDD1通过减少肝损伤和抑制胶原积累，有效减轻了BDL诱导的肝纤维化。

REDD1抑制肝纤维化基因/蛋白表达

为进一步评估REDD1的抗纤维化作用，检测了纤维化标志物如α-SMA和胶原蛋白I，这些是肝星状细胞活化的指标。与对照组相比，REDD1在腺病毒转染的实验组中明显增加，表明REDD1成功过表达。免疫组化分析显示，与未处理的BDL诱导的纤维化小鼠相比，Ad-REDD1处理的小鼠α-SMA和胶原蛋白I表达显著降低，定量分析表明这些纤维化标志物的蛋白水平降低。此外，RT-qPCR分析显示，Ad-REDD1处理显著下调了BDL诱导的纤维化小鼠肝组织中α-SMA和胶原蛋白I的mRNA水平。另外，REDD1和α-SMA的共免疫荧光染色显示，REDD1过表达增加了α-SMA点状区域，暗示REDD1可能通过作用于HSCs发挥其抗肝纤维化作用。这些发现表明，REDD1通过抑制关键纤维化基因和蛋白的表达改善肝纤维化，进一步支持其在减轻BDL诱导的肝损伤和纤维化中的作用。

PI3K/AKT/mTOR通路参与REDD1对肝纤维化的治疗作用

PI3K/AKT/mTOR信号通路通过调节关键细胞过程如HSCs活化、增殖和存活，在肝纤维化的发展和进展中起着关键作用。该通路的激活促进静止HSCs向肌成纤维细胞转化，后者负责ECM沉积，这是纤维化的标志。据报道，抑制PI3K/AKT/mTOR通路可减轻肝纤维化。本研究免疫组化分析显示，与未处理的BDL诱导的纤维化小鼠相比，Ad-REDD1处理的小鼠磷酸化PI3K（P-PI3K）、AKT（P-AKT）和mTOR（P-mTOR）表达显著降低。定量分析进一步证实Ad-REDD1处理显著降低了P-PI3K、P-AKT和P-mTOR水平，表明REDD1通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活发挥其抗纤维化作用。这些发现强调了PI3K/AKT/mTOR通路在介导REDD1对抗BDL诱导的肝纤维化保护作用中的参与。

讨论

PBC是一种慢性肝内胆汁淤积性肝病。由于目前缺乏有效治疗，它最终可从早期肝纤维化发展为需要肝移植的终末期肝病。小鼠胆总管结扎是产生胆汁淤积性肝纤维化动物模型的经典方法。越来越多的证据表明，转录组改变与人类疾病相关，范围从癌症到自身免疫性疾病再到心血管病理学。本研究通过RNA高通量测序探索BDL诱导的肝纤维化转录组变异。

与先前研究一致，许多病理特征的出现包括胆囊增大、胆管扩张和胶原纤维形成表明BDL诱导的肝纤维化模型成功建立，为下一步测序做好准备。通过研究差异基因表达，期望发现BDL诱导的肝纤维化的可能基因靶点，并进一步描述潜在信号通路，可能为临床治疗胆汁淤积性肝纤维化提供新思路。

通过转录组信息分析，共获得239,727,428条清洁读段。经过数据获取和比较分析，获得了22,299个基因的FPKM值用于后续分析，最终得到3,224个DEGs。当前研究显示BDL诱导的肝纤维化中mRNA显著改变。先前研究发现自噬促进HSCs活化，从而加剧肝纤维化。为获得与自噬相关的候选应答基因，基于p值、log2FC和自噬通路PI3K/AKT/mTOR筛选DEGs，最终得到7个DEGs，包括SGK1、REDD1、NGF、Col1α2、Col1α1、IGHA、Spp1。

REDD1通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTOR1）依赖或非依赖机制调节多种内在细胞活动，从而发挥保护功能。越来越多的证据表明REDD1调节各种细胞和代谢过程，包括自噬。通过验证实验，发现REDD1在PBC患者肝组织中升高，但出乎意料的是，REDD1过表达改善了BDL诱导的肝功能和肝纤维化。原因可能是反馈调节机制，REDD1的上调可能是一种补偿性增加，代表对抗纤维化进展和肝细胞损伤的补偿机制，反映了对慢性胆汁淤积性损伤的适应性反应。REDD1在胆汁淤积性肝病中具有潜在保护作用，可能是胆汁淤积性肝纤维化的靶基因。然而，由于腺病毒载体固有的细胞特异性缺乏，Ad-REDD1给药后REDD1在所有肝细胞类型中过表达，目前尚不清楚肝脏中哪些特定细胞被REDD1靶向以发挥其抗肝纤维化作用。需要进一步研究来识别这些靶细胞。

PI3K/AKT/mTOR信号通路通过调节关键细胞过程如HSCs活化、增殖和存活，在肝纤维化的发展和进展中起着关键作用。该通路的激活促进静止HSCs向肌成纤维细胞转化，后者负责ECM沉积，这是纤维化的标志。据报道，抑制PI3K/AKT/mTOR通路可减轻肝纤维化。因此，在PBC患者中发现的PI3K/AKT/mTOR通路激活可能与临床胆汁淤积性肝纤维化的发生密切相关。PI3K/AKT/mTOR通路在介导REDD1抗纤维化作用中的参与突出了其在调节肝纤维化中关键信号级联中的作用。然而，需要进一步研究阐明REDD1介导的PI3K/AKT/mTOR调节，需要使用PI3K抑制剂（如LY294002）和通路活性测量或拯救实验的细胞实验来建立这种机制联系。当前研究受限于人类肝组织样本量小、缺乏REDD1敲低/KO模型与过表达对比、腺病毒载体用于细胞类型特异性表达的固有局限性、BDL模型以外的普遍性。在未来的研究中，将专注于在更多人类肝样本中验证这些发现，并研究REDD1过表达和敲低对更多肝纤维化模型（如CCL4模型）的治疗效果，以探索REDD1基于疗法在临床环境中的潜力。

结论

总之，本研究确定了REDD1通过PI3K/AKT/mTOR通路减轻肝纤维化，是治疗胆汁淤积性肝纤维化的新靶点。研究旨在为临床胆汁淤积性肝病的药物治疗提供新视角。