超声引导下胎盘基因治疗在兔宫内生长受限模型中的有效性及对后代发育的影响研究

　　本研究创新性地评估了超声引导下腺病毒载体介导的胰岛素样生长因子1（IGF-1）与血管内皮生长因子（VEGF）胎盘内注射治疗兔宫内生长受限（IUGR）模型的可行性及安全性。结果表明，该微创技术可有效实现转基因表达（尤其肺肠组织），VEGF过表达显著改善IUGR后代生长发育、代谢指标（如降低NEFA、LDL-c）及器官结构（肺泡/肠绒毛增殖），为胎盘 insufficiency相关疾病的临床基因治疗提供了重要 preclinical 依据。

　　

1 引言

宫内生长受限（IUGR）指胎儿无法实现其遗传潜力所决定的生长水平，当前影响高达10%的人类妊娠。IUGR与多种急性医学并发症相关，包括围产期窒息、肺成熟延迟、表面活性物质生成减少、低温、早产和死亡。此外，大量人群及实验动物研究表明，低出生体重与代谢紊乱（脂肪组织分布异常、胰岛素抵抗、糖尿病、血脂异常和代谢综合征）、心血管改变（心脏和血管系统的结构与功能变化导致高血压、缺血性心脏病和中风风险增加）以及其他器官如肺、肾或肠的功能障碍风险增加密切相关。

IUGR的发生多与子宫内营养和/或氧气供应不足有关。传统上，IUGR多见于低收入国家，与母亲营养不良（如社会经济劣势、食物短缺或饮食不当）或母亲低压缺氧（如居住或访问高海拔地区的孕妇）相关。然而，当前在发达国家，IUGR的发病率显著增加，这与胎盘因素（胎盘发育和/或功能异常以及营养和氧气向胎儿的输送不足）密切相关。这种称为胎盘功能不全的状况，是当今IUGR病例的主要原因之一。

最令人担忧的是，胎盘功能不全预计在不久的将来会显著增加，因为它与多种病理和行为因素高度相关（即先兆子痫、肥胖、糖尿病、压力、营养不良、久坐习惯、生育年龄推迟、污染以及酒精和烟草消费）。另一个令人担忧的因素是，目前没有经过验证的有效行动来预防或改善胎盘功能不全，因此目前的治疗仅基于生活方式和饮食的改变。因此，迫切需要预防和治疗策略。此类治疗应基于促进胎盘/胎儿组织发育或促进胎盘血管生成和血管舒张过程。

胎儿/胎盘组织的发育，特别是胎儿生长和肌肉发育，由胰岛素和胰岛素样生长因子1（IGF-1）等多种因子激活。IGF-1信号在产前发育中至关重要，因为它与生长激素（GH）一起调节代谢过程，包括蛋白质合成和胎儿胎盘单位的组织发育。此外，IGF-1通路缺陷与IUGR的产前和产后后果之间的联系已明确建立。胎盘功能不全也与器官的血管疾病有关。

目前的证据强调了IUGR与促血管生成因子缺陷之间的联系，主要是血管内皮生长因子（VEGF）和一氧化氮（NO）途径。VEGF被认为是脂质代谢的关键调节因子，糖蛋白VEGF-D信号传导的抑制导致与甘油三酯和胆固醇合成相关的基因表达降低。VEGF还通过产生NO和前列腺素I2（PGI2）促进血管生成、血管舒张和血管通透性。因此，有描述表明，在胎盘功能不全的情况下，使用低剂量阿司匹林可能有助于抵消IUGR，因为乙酰水杨酸增加了PGI2的产生。然而，常规服用阿司匹林的优点仍然存在争议，也有许多缺点被指出。NO是胎盘中的主要血管舒张剂，促进胎儿稳态、发育和生长。氨基酸L-精氨酸是酶NO合酶（NOS）的底物，在NO的产生中起关键作用，因此，母亲服用精氨酸已被广泛研究。

无论如何，这些疗法基于向母亲口服高剂量的物质，以获得全身水平的高浓度，从而在胎儿胎盘水平达到治疗浓度，此外，还可能面临胎盘转运不足的问题。因此，强烈趋势是研究其他策略，基于以胎儿为重点的治疗，直接向胎儿给药或通过脐带、羊膜囊或胎盘输注。显然，由于直接给药时胎儿损伤的高风险或在脐带、胎盘或羊膜囊给药时液体/血液流失的高风险，此类研究必须在临床前动物模型中进行。

目前，以胎儿为重点的策略研究大多基于基因治疗的给药，特别是用于诱导腺病毒介导（Ad）的生长因子过表达，主要是IGF-1和VEGF，鉴于其如前所述的重要性。腺病毒给药IGF-1已被发现可增加小鼠、兔子和羊的产前和产后后代发育，并预防与IUGR相关的肝脏、肌肉骨骼和心血管功能障碍，而VEGF的给药已被发现可增加子宫血流并改善羊模型的胎儿生长。

然而，关于以胎儿为重点的疗法的实验数据仅通过使用高度侵入性的方法接种Ad（通过剖腹术或导管插入术将生殖道外部化）获得，因此该技术尚不能外推至临床实践。我们假设，IGF-1和VEGF的腺病毒给药可以通过使用腺病毒载体5的超声引导注射进行，对IUGR发育产生与先前描述相似的效果。因此，使用兔妊娠和IUGR模型，我们的主要目的是评估（a）一种替代微创技术，即超声引导注射，用于在胎盘或羊膜囊中施用表达报告基因（Ad5-βgal）的Ad的可行性和效率，以及（b）使用此种技术单次Ad给药诱导的IGF-I或VEGF过表达对后代产后生长、器官结构和代谢的可能影响。

2 材料与方法

本研究报告了三个连续试验的结果，其中涉及来自26只多产新西兰 x 加利福尼亚杂交雌兔的总共176个兔胎儿。第一个试验通过评估后代的产前和产后发育，确定了超声引导胎儿穿刺的安全性和可能的长期影响。第二个试验评估了超声引导施用表达报告基因β-半乳糖苷酶（Ad5-βgal）的腺病毒载体的效率，该基因因其在适当底物存在下产生显色化合物的能力而被广泛用作各种生物学测定中的标记物。第三个试验评估了腺病毒递送生长因子后IUGR胎儿产后发育的可能变化。

所有实验程序均在马德里理工大学（UPM，马德里，西班牙）的实验农场进行，遵循欧盟指令和西班牙动物保护政策RD53/2013，该政策规定了用于实验和其他科学目的（包括教学）的动物的管理。马德里理工大学（UPM，马德里，西班牙）动物研究伦理委员会批准了实验程序（《兔产前期间胎盘内注射的安全性》，批准日期为2020年12月22日）。所有母兔随意饲喂含有16%粗蛋白、37%粗纤维和3.7%脂肪、总能量含量为2,400 kcal/kg的商业饲料（Nanta，马德里，西班牙），在个体笼中于受控温度（18–24 °C）、光照（14小时光照和10小时黑暗）和相对湿度（60–75% RH）条件下，并自由饮水。新西兰 x 加利福尼亚杂交雌兔的平均妊娠长度为31天，人工授精日被视为妊娠第0天。超声引导穿刺和治疗在妊娠第26天进行，恰好在IUGR后代明显生长停滞期之前，该期大约在妊娠总长度的85–90%变得明显。

2.1 第一个试验：超声引导穿刺的安全性和长期影响

第一个试验涉及来自11只临床健康的12月龄雌兔的总共59只后代，分布在四个实验组中。使用两个潜在治疗组评估在胎盘（组PLA，n = 14）或羊水（组AMN，n = 15）中施用生理盐水的安全性；两个对照组，无超声引导胎儿穿刺，用于确定处理程序的可能影响，无论是否对雌兔进行镇静（组CONSED，n = 16，和组CON，n = 14）。

在妊娠第26天（认为第0天为人工授精日），组PLA、AMN和CONSED的母兔用肌注咪达唑仑（0.8 mg/kg；Midazolam 5 mg/mL，Normon Laboratories，马德里，西班牙）和布托啡诺（0.4 mg/kg；Torbugesic Vet 10 mg/mL，Zoetis，马德里，西班牙）镇静。之后，雌兔保持仰卧位，在剃除腹部区域后，使用配备线性探头（4–11 MHz）的超声机器（Omega，Esaote，巴塞罗那，西班牙）确认妊娠；评估平均体直径以确定适合胎龄的胎儿发育。随即，使用23 G针头（0.6 × 60 mm Sterican，Braun，马德里，西班牙）向组PLA和AMN中的所有胎儿施用300 μL生理盐水（FisioVet，Braun，马德里，西班牙）。通过观察注射区域的气泡以及识别针穿刺对应的强回声点来检查给药的适当性。

在所有母兔中，允许自然分娩，所有活产仔兔在出生时进行单独评估和称重。在4周龄断奶后，后代在兔标准饲养条件下单独饲养在平底笼中。在生命的前13周内，每2周记录一次动物发育（体重）和健康状况（存活率）。

2.2 第二个试验：超声引导施用表达报告基因的腺病毒载体的效率

第二个试验涉及来自两只临床健康的12月龄雌兔的总共17个兔胎儿。在妊娠第26天，两只母兔如第一个试验所述进行镇静和处理。表达β-半乳糖苷酶的腺病毒载体（Ad5-βgal，剂量为7×10⁷空斑形成单位（PFU）/ml，Vector Biolabs，Malvern，美国）以300 μL的注射体积施用，并使用23G针头在除最靠近卵巢的胎儿外的所有胎儿的胎盘中进行给药，这些胎儿用作评估造影剂或腺病毒载体可能负面影响的对照。

施用腺病毒三天后，两只母兔通过镇静和颈椎脱位处死，符合兔安乐死方法（RD 53/2013附件III）。立即，将完整子宫外部化，并在其植入部位逐个回收胎儿。随即，在所有胎儿中获取肺、肝、肾、肠、心脏和胎盘的两个样本，每个约500 mm³。每个样本进行宏观评估以检查任何可能的组织损伤，并立即保存在磷酸盐缓冲盐水（PBS；Phosphate Buffer Saline pH 7.0，Reagecon，Lismacleane，爱尔兰）中于-80 °C保存24小时，之后在干冰上用含PBS和Mg²⁺离子的0.5%戊二醛固定2小时。戊二醛固定后，进行PBS洗涤以去除残留固定剂，并将样本与X-gal反应缓冲液在37 °C孵育3小时。X-gal反应缓冲液含有30 mM亚铁氰化钾、30 mM铁氰化钾、2 mM MgCl₂、0.02% Nonidet P-40（一种非离子和非变性去污剂）和0.01%脱氧胆酸钠在PBS中。与X-gal孵育后，用PBS冲洗组织五次，之后确保溶液不再呈黄色。

显微镜研究在蔗糖溶液（Sucrose Crystalline S5-3，Thermo Fisher Scientific，马德里，西班牙）中嵌入后进行，随后进行冷冻保存以防止水冻结和膨胀时组织中形成冰晶。之后，将样本切成2 μm切片并安装在载玻片上。使用显微镜数码相机（BA210 LED with 1080INT；Motic，巴塞罗那，西班牙）进行显微镜评估，首先评估任何可能的组织损伤；之后，将Ad的表达水平量化为1（轻度或局灶表达）、2（中度和/或多灶表达）或3（强烈和弥漫表达）。每个样本评估三个切片，并对每个动物的每个组织取平均值。

2.3 第三个试验：使用Ad治疗生长因子过表达对IUGR胎儿产后发育的影响

第三个试验涉及来自13只临床健康的12月龄雌兔的总共100个兔胎儿。在妊娠第9天，将母兔随机分为两组，用于后续评估IUGR胎儿的发育模式。第一组（对照组或CON，来自5只雌兔的42个胎儿）在整个妊娠期间随意饲喂。通过母体饮食限制在第二组（组IUGR，n = 来自8只雌兔的58个胎儿）中诱导IUGR状况，使用我们实验室先前开发的IUGR模型。总结而言，从妊娠第9天到分娩日，组IUGR中的母兔限制在其平均每日食物摄入量的50%。此类每日摄入量计算为187.0 ± 11.0 g/天。之后，组IUGR根据在胎盘接受的治疗随机分为三个子集。第一个子集未接受治疗（组IUGR-CON，n = 来自3只雌兔的28个胎儿），而两个子集在妊娠第26天接受超声引导胎盘内基因治疗，如第二个试验所述。血管内皮生长因子（VEGF；组IUGR-VEGF，n = 来自3只雌兔的19个胎儿）通过Ad-VEGF以1×10¹⁰ PFU/ml的剂量（Vector Biolabs，Malvern，美国）过表达；胰岛素样生长因子1（IGF-1；组IUGR-IGF，n = 来自2只雌兔的11个胎儿）通过Ad-IGF1以5×10¹⁰ PFU/ml的剂量（Vector Biolabs，Malvern，美国）过表达。在所有