基于FecB基因型差异的皮山红羊与湖羊发情期卵巢组织lncRNA与mRNA差异表达谱及繁殖力调控机制研究

　　本研究通过转录组测序技术，系统性分析了FecBB+和FecB++基因型皮山红羊与湖羊发情期卵巢组织中长链非编码RNA（lncRNA）和信使RNA（mRNA）的差异表达谱，揭示了关键繁殖性状相关基因（如GDF9、AMH、MMP9）及其调控网络，为绵羊繁殖性能改良提供了分子机制依据和潜在调控靶点。

　　

引言

皮山红羊与湖羊作为中国本土重要绵羊品种，因其独特的繁殖特性受到广泛关注。皮山红羊以高繁殖力著称，而湖羊则具有"终年发情、多胎高产"特征，是研究高繁殖力机制的理想模型。哺乳动物产羔数性状受遗传、环境和激素水平等多因素调控，其中卵巢作为关键生殖器官，通过分泌性激素和产生卵母细胞调控繁殖周期。随着高通量测序技术的发展，长链非编码RNA（lncRNA）在绵羊繁殖调控中的作用日益凸显。不同FecB基因型绵羊繁殖性能存在显著差异，FecB^B+基因型个体产羔数（1.453±0.063）显著高于FecB⁺⁺基因型（1.125±0.059）。目前针对不同FecB基因型皮山红羊与湖羊发情期卵巢组织lncRNA和mRNA差异表达的研究仍较缺乏。

材料与方法

实验动物来自和田地区皮山县西域牧羊人农牧有限公司，选择健康、无亲缘关系、7-8月龄空怀母羊，每组n=4。实验分为三组：湖羊（FecB^BB）组、FecB^B+基因型皮山红羊组和FecB⁺⁺基因型皮山红羊组。采用前列腺素F2α（PGF2α）法进行同期发情处理，48小时后通过公羊试情法检测发情行为。采集卵巢组织样品后立即用液氮速冻。使用TRIzol试剂提取总RNA，通过NanoDrop 2000测定浓度，Agilent 2100 Bioanalyzer评估完整性。建库后在NovaSeq X Plus平台上进行150bp双端测序，获得204.58Gb清洁数据。使用BMKCloud平台生物信息学流程分析数据，差异表达基因（DEG）和lncRNA的筛选标准为|Fold Change|≥1.5且p值<0.01。通过趋势分析、GO和KEGG富集分析筛选关键基因，采用qRT-PCR验证测序结果。

结果

总RNA质量评估

RNA浓度范围为98.9-652.8ng/μL，总产量1.48-9.79μg，RNA完整性数（RIN）为6.1-8.8，28S/18S rRNA比值为1.0-4.03，所有样品均符合建库质量要求。

测试数据质量与比对信息

经严格质控后，Q20>97.45%，Q30>93.31%，N比率低，GC含量稳定。参考基因组比对率为81.40-91.19%。

绵羊不同繁殖力卵巢中lncRNA和mRNA的比较分析

使用CNCI、CPC2、Pfam Scan和CPAT四种计算工具评估lncRNA编码潜能，鉴定出34,651个高置信度lncRNA，其中基因间lncRNA（15,611，45.1%）、反义lncRNA（3,462，10%）、内含子lncRNA（15,062，43.5%）和正义lncRNA（516，1.5%）。lncRNA表达水平整体低于mRNA，转录本长度分布显示lncRNA主要分布在200-400bp，而mRNA主要≥3,000bp。

不同组间lncRNA和mRNA的差异表达分析

三组比较（A-L vs. B-L、A-L vs. C-L、B-L vs. C-L）分别鉴定出92个（56上调，36下调）、269个（144上调，125下调）和466个（217上调，249下调）差异表达lncRNA，以及141个（60上调，81下调）、1,397个（685上调，712下调）和1,821个（830上调，991下调）差异表达mRNA。Venn分析显示1,481个共享差异表达mRNA和698个共享差异表达lncRNA。

mRNA和lncRNA的表达趋势

通过趋势分析筛选出888个差异表达mRNA和6,740个差异表达lncRNA符合繁殖性能趋势。选择标准为在三组中表达趋势持续增加或减少，在B组表达较低而在A和C组表达较高，或在B组表达较高而在A和C组表达较低。

lncRNA靶基因预测

通过Perl脚本预测±100kb基因组区域内蛋白编码基因作为顺式作用靶基因，得到845个顺式靶标对。通过Pearson相关分析样本间共表达模式预测反式作用靶基因，鉴定出5,895个反式靶标互作。

mRNA功能富集分析

对888个趋势差异表达基因进行功能富集分析，发现60个GO条目和285个KEGG通路显著富集。生物过程（BP）中显著富集"细胞过程"和"代谢过程"等关键术语。KEGG通路分析显示多个通路差异富集，包括半胱氨酸和蛋氨酸代谢、轴突引导和Fcγ受体介导的吞噬作用等。与繁殖相关的通路包括孕酮介导的卵母细胞成熟、雌激素信号通路和促性腺激素释放激素（GnRH）信号通路。

ncRNA靶基因功能富集分析

对6,704个符合趋势的lncRNA预测的845个顺式靶基因和5,859个反式靶基因进行功能富集分析，分别显著富集60和63个GO条目，以及289和330个KEGG通路。顺式靶基因GO富集分析显示生物过程中"细胞过程"、"单生物过程"、"生物调节"和"代谢过程"显著富集。KEGG通路分析显示"细胞因子-细胞因子受体相互作用"、"Hippo信号通路"和"雌激素信号通路"等多个通路差异富集。反式作用靶基因GO富集分析显示，生物过程类别中"细胞过程"和"单生物过程"等条目富集的lncRNA反式作用靶基因数量相对较多。KEGG通路分析显示"细胞因子-细胞因子受体相互作用"、"MAPK信号通路"和"cGMP-PKG信号通路"等关键通路显著富集。"MAPK信号通路"和"cAMP信号通路"在顺式和反式靶基因KEGG分析中均一致富集。

繁殖过程中潜在功能mRNA和lncRNA的筛选

功能富集分析鉴定出发情期卵巢组织中一批显著表达的mRNA和lncRNA，特别是在"细胞因子-细胞因子受体相互作用"、"Hippo信号通路"和"MAPK信号通路"等关键KEGG通路中富集。

转录组分析在mRNA水平鉴定出关键基因，包括GDF9、GRIA4、HOXC9、HOXD3、MAPK8IP3、AMH、ANGPT2、FGF14、MAPK8IP1、MMP9和BRINP3，这些基因在卵巢卵泡生成、细胞周期调节和MAPK介导的信号转导级联中发挥多方面作用。mRNA表达水平条形图分析显示基因表达存在品种间显著差异，这些转录差异可能与繁殖性能变异相关。

AMH基因在FecB⁺⁺基因型皮山红羊（B组）中的表达水平显著高于FecB^B+基因型（A组）和湖羊（C组）。这种转录模式表明AMH可能在单排卵品种的卵泡静止调节中发挥更重要作用，而在多排卵品种中其活性可能通过互补调节机制进行调控。ANGPT2基因在FecB⁺⁺基因型皮山红羊中表达水平最高，与FecB^B+基因型和湖羊相比。这种表达模式可能与其在调节卵巢血管生成和繁殖周期中卵泡成熟的双重作用相关。FGF14基因在FecB⁺⁺基因型皮山红羊中表达水平最高，而在FecB^B+基因型和湖羊中表达显著较低。这种差异表达模式可能与FGF14在细胞增殖和分化中的调节功能相关。HOXC9和HOXD3基因在FecB⁺⁺基因型皮山红羊中的表达水平显著低于其他基因型，表明可能与其在胚胎形态发生和细胞分化过程中的调节作用相关。MAPK8IP1和MMP9在FecB⁺⁺基因型皮山红羊中表达水平最高，可能与其在卵泡成熟、排卵动态和卵巢组织稳态过程中细胞外基质重塑中的功能作用相关。

通过系统分析鉴定的关键lncRNA包括MSTRG.61044.1、MSTRG.2677.1、MSTRG.23016.1、MSTRG.27015.1、MSTRG.60286.1和MSTRG.15154.3，这些lncRNA在基因型组间表现出保守的表达模式。结果显示这些lncRNA在绵羊品种间存在显著差异表达，这种转录差异可能与繁殖性能变异相关。

具体而言，在FecB⁺⁺基因型皮山红羊中高表达的lncRNA MSTRG.61044.1展示双重调节机制：对相邻MAPK8IP1基因进行顺式调节控制，同时反式调节繁殖相关基因如AMH和CCL25。这些发现表明MSTRG.61044.1可能是协调卵泡选择和促性腺激素响应信号级联的核心调节因子。进一步研究发现，同样在FecB⁺⁺基因型皮山红羊中高表达的MSTRG.23016.1对MMP9和ANGPT2转录本进行功能调节，表明其可能参与卵巢组织稳态过程中的细胞外基质重塑和血管生成微环境调节。同时，MSTRG.15154.3通过ERBB4的顺式介导转录控制动态调节颗粒细胞增殖和谱系定型，建立了lncRNA驱动的染色质相互作用与卵泡发育能力之间的机制联系。

相比之下，湖羊特异性高表达lncRNA表现出独特的功能导向：MSTRG.2677.1通过HGF和BRINP3的反式调节调节卵巢基质细胞稳态，可能协调卵泡波进展过程中的细胞外基质动态和基质-上皮交叉对话。MSTRG.27015.1和MSTRG.60286.1分别靶向MAPK8IP3和PPP3CB。这种机制关联表明它们可能通过钙依赖性信号级联在调节细胞周期检查点和协调卵母细胞成熟中发挥潜在作用。值得注意的是，MAPK信号通路相关基因（MAPK8IP1和MAPK8IP3）受到不同lncRNA的品种特异性差异调节，这可能反映了绵羊品种间卵泡发育同步化机制的进化分歧。

关键mRNA-lncRNA相关性分析

关键差异表达mRNA和lncRNA之间的相关性热图显示这些RNA分子根据表达相关性模式明显分为两组。具体而言，lncRNA MSTRG.23016.1和MSTRG.61044.1与关键繁殖调节因子包括AMH、ANGPT2、MMP9、FGF14和MAPK8IP1呈强正相关，而与HOXD3基因呈强负相关。此外，lncRNA MSTRG.2677.1、MSTRG.27015.1、MSTRG.60286.1和MSTRG.50603.1与GRIA4、MAPK8IP3、GDF9、HOXC9和BRINP3 mRNA呈强正相关。值得注意的是，lncRNA MSTRG.50603.1还与MAPK8IP1、FGF14和MMP9 mRNA呈强负相关。此外，MSTRG.15154.3与FGF14和MAPK8IP1呈强正相关，而与GRIA4、MAPK8IP3、GDF9、HOXC9和BRINP3呈负相关。这种基于相关性的共表达分析在精确识别RNA调节网络内推定功能互作方面被证明具有重要意义，对破译转录电路和阐明控制卵巢卵泡生成的分子机制具有重要影响。

实时定量PCR（RT-qPCR）验证

为评估RNA测序的可靠性，随机选择4个mRNA（MMP9、AMH、ANGPT2、MAPK8IP3）和1个lncRNA（MSTRG.60286.1）进行qRT-PCR验证。结果显示qRT-PCR与RNA-Seq数据在不同繁殖阶段表达模式一致，证实了转录组分析的可靠性。

讨论

绵羊繁殖效率研究表明，GDF9和BMP15等基因表达水平升高与卵泡发育密切相关，表明它们可能作为提高繁殖性能的分子靶点。本研究中GDF9基因在湖羊中表达水平最高，其次是FecB^B+基因型皮山红羊，FecB⁺⁺基因型皮山红羊表达最低。这一发现表明GDF9表达水平与绵羊繁殖力可能存在正相关关系，即表达升高可能增强繁殖力性状。虽然ELOVL7（脂质代谢）和GDF9（繁殖调节）在 distinct功能背景下运作，但都通过调节关键信号通路影响细胞命运。这为阐明绵羊复杂性状的多组织协同调节机制提供了跨表型研究见解。先前研究表明GDF9表达水平在绵羊群体中存在显著的品种特异性变异，表达升高与排卵率增加和产羔数改善观察到的强相关性。

MMP9在绵羊卵巢组织中表达水平升高，显著活性在卵泡发育过程中特别观察到。MMP9表达升高可能促进卵泡成熟和排卵，从而提高排卵率。研究表明，MMP9表达在卵泡成熟过程中显著增加，在发育良好的成熟卵泡的卵泡膜和颗粒细胞中观察到最高水平。这些发现共同表明MMP9可能在协调绵羊卵巢组织内卵泡发育和排卵过程中发挥调节作用，为其对繁殖效率的贡献提供了机制见解。研究表明MMP9缺陷小鼠表现出胚胎发育受损和母胎相互作用失调，特征为宫内生长迟缓和产仔数减少。这一证据强烈表明MMP9对滋养层细胞分化和胎盘成熟发挥关键调节影响，这些过程中的功能紊乱直接导致繁殖结果受损。MMP9表达的紧密调节对于维持生理稳态不可或缺，而失调的表达可能与生殖病理如卵泡生成受损和妊娠疾病有病因学联系。MMP9通过细胞外基质降解参与子宫重塑，从而影响胚胎植入和妊娠维持。

BRINP3在绵羊卵巢组织中表达升高及其在多产羊中的显著差异表达表明其在介导关键繁殖过程中可能具有功能意义。BRINP3可能调节促性腺激素的表达，从而调节卵泡发育和排卵。AMH在绵羊卵巢组织中表达升高及其在卵泡发育中的关键作用表明其在调节绵羊繁殖过程中可能具有关键功能。实验结果表明AMH缺陷小鼠表现出显著加速的卵泡耗竭，为AMH与繁殖寿命调节的功能关联提供了直接证据。本研究首次阐明AMH通过双重机制维持卵泡发育的动态平衡：抑制原始卵泡募集和调节颗粒细胞中卵泡刺激素（FSH）受体表达。AMH-FSH-抑制素B三方反馈调节系统的建立表明AMH抑制颗粒细胞中FSH受体表达（体外观察到40%下调），从而延长小窦卵泡的存活持续时间并增强排卵潜力。

Hox基因是同源框超家族内高度保守的亚群，在发育过程中发挥关键作用。具体而言，HOXC9和HOXD3主要负责协调前后轴形成并参与特殊器官系统的形态发生。它们的表达通常表现出显著的时间和空间特异性，对生殖系统的发育和功能稳态产生深远调节影响。对这些基因表达模式和功能作用的研究为理解其在绵羊生殖生物学中的潜在调节机制提供了关键见解。

研究日益表明lncRNA在生物生命周期和繁殖过程中发挥不可或缺的作用。研究揭示lncRNA深度参与多个繁殖过程，包括卵巢发育、卵子发生和妊娠维持，为研究lncRNA介导的绵羊繁殖性能调节提供了关键机会。本研究中通过比较皮山红羊和湖羊发情期卵巢组织lncRNA和mRNA表达谱，成功鉴定出关键候选mRNA及其潜在调节lncRNA。这些发现进一步证实了lncRNA在绵羊繁殖中的关键作用。

lncRNA通过顺式和反式作用机制调节mRNA表达。顺式作用lncRNA通过增强子样机制调节靶基因表达，激活或抑制转录。反式作用lncRNA通过与蛋白质、DNA和其他RNA相互作用调节mRNA剪接、稳定性和翻译。研究表明脂多糖（LPS）处理诱导牛乳腺上皮细胞中lncRNA和信使RNA（mRNA）表达谱的显著改变。对FecB⁺⁺基因型小尾寒羊下丘脑lncRNA的RNA测序分析鉴定出潜在繁殖调节因子如MSTRG.26777和MSTRG.105228。这些发现为绵羊繁殖的下丘脑调节提供了新见解。本研究中鉴定的与绵羊繁殖力相关的lncRNA和mRNA证实了这些发现，为lncRNA在绵羊繁殖中的关键作用提供了进一步证据。系统表征了湖羊卵巢 across卵泡发育阶段的阶段特异性lncRNA和mRNA表达谱，鉴定出形成潜在调节网络的差异表达miRNA和lncRNA。鉴定出的基因在功能上与卵巢卵泡发育和类固醇激素介导的信号通路等关键繁殖过程相关。这些发现与本研究中鉴定的lncRNA的作用一致——调节卵泡选择、激素响应、卵巢组织重塑和细胞增殖/分化——共同推进了对绵羊繁殖的机制理解。然而，特定候选基因的功能验证仍有必要。

结论

本研究通过系统分析皮山红羊和湖羊发情期卵巢组织lncRNA和mRNA的差异表达谱，阐明了绵羊繁殖效率的分子决定因素，揭示了卵泡发育和排卵能力中的关键遗传调节因子及其多方面机制。通过系统转录组筛选成功鉴定出一套关键mRNA，包括GDF9、GRIA4、HOXC9、HOXD3、MAPK8IP3、AMH、ANGPT2、FGF14、MAPK8IP1、MMP9和BRINP3。此外，我们还鉴定了与这些mRNA有调节互作的lncRNA，包括MSTRG.61044.1、MSTRG.23016.1、MSTRG.15154.3、MSTRG.2677.1、MSTRG.27015.1和MSTRG.60286.1。这些lncRNA通过协调的顺式和反式调节机制在卵泡选择、激素响应性、卵巢组织重塑和细胞增殖/分化中发挥关键调节作用。本研究结果为完善绵羊繁殖管理策略建立了分子框架，并指出了可能作为繁殖效率关键调节因子的关键基因调节枢纽。