源自iPSCs的稳定功能性人肠上皮细胞：突破Caco-2局限的新型药物筛选模型

　　为解决Caco-2细胞药物代谢能力不足导致的人体生理相关性差的问题，研究人员开展了人诱导多能干细胞(iPSCs)来源肠上皮细胞的功能研究。通过建立2D培养扩增体系，获得可稳定传代的功能性细胞，其屏障功能、转运体活性及CYP3A4高表达等小肠特性持续稳定，为药物吸收代谢研究和器官芯片技术提供了更优的体外模型。

　　

在药物研发领域，准确预测药物在人体内的吸收、代谢和毒性是至关重要的环节。目前广泛使用的人结肠癌细胞系Caco-2虽然具备屏障功能和转运体活性，但其药物代谢能力存在明显缺陷——特别是缺乏代谢大多数药物的关键酶CYP3A4和参与前药代谢的CES2，这导致实验结果与人体实际生理情况存在显著差异。随着三维肠道类器官技术的发展，科学家们虽然能够培养出模拟小肠黏膜结构的类器官，但由于其尺寸微小、腔面向内等结构限制，在药物代谢产物分析等下游应用方面仍面临巨大挑战。

为了解决这些技术瓶颈，日本国立成育医疗研究中心的研究团队开展了一项创新性研究，相关成果发表在《Drug Metabolism and Disposition》。研究人员建立了一种从人多能干细胞来源的肠道类器官中衍生肠上皮细胞(IO-IEC)的新型二维培养体系，并系统评估了这些细胞在多次传代过程中的功能稳定性。

研究团队运用了几项关键技术：首先通过人多能干细胞定向分化为肠道类器官，进而分离出肠上皮细胞和间充质基质细胞(IO-MSC)；建立基于IO-MSC为饲养层的IO-IEC二维扩增体系，实现细胞的长期传代培养；采用转录组测序(RNA-seq)进行全基因组表达分析；通过透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察细胞超微结构；使用Transwell系统测定跨上皮电阻(TEER)和表观渗透系数(P_app)评估屏障功能；采用LC-MS/MS技术检测细胞色素P450酶活性；并通过免疫组化分析关键蛋白的表达与定位。

研究结果

器官来源的肠上皮细胞具有高增殖能力

研究人员从人iPSCs来源的肠道类器官中成功分离出肠上皮细胞，并在间充质基质细胞支持下建立稳定的二维培养体系。细胞在传代至第12代时仍保持正常的染色体核型，显微观察显示细胞小而密集，组织学分析证实细胞呈现典型的柱状上皮形态，并表达小肠上皮细胞标志物CDX2和AE1/3。透射电镜显示细胞顶膜存在微绒毛和糖萼结构，且随着传代代次增加，微绒毛长度和糖萼密度有所增加，表明细胞逐渐成熟。

细胞复制对功能影响较小

RNA-seq分析显示，第6、9、12代IO-IEC的整体基因表达变化很小，小肠特异性基因表达谱高度相似，与间充质细胞和冷冻人肠细胞明显不同。虽然第12代细胞中增殖相关基因表达有所下降，但肠上皮细胞功能相关基因的表达保持稳定。

器官来源肠上皮细胞的屏障功能随时间保持

免疫染色显示，第6、9、12代IO-IEC均表达参与粘附连接的ECAD和CDH17，以及参与紧密连接的ZO-1和Claudin-7。透射电镜证实了紧密连接和粘附连接的形成。TEER测量表明第9代细胞屏障功能最高，而荧光黄渗透性实验显示各代次细胞P_app值保持稳定，表明屏障功能在长期培养中相对稳定。

器官来源肠上皮细胞的转运功能随时间保持

qRT-PCR分析显示，P-gp、BCRP和PEPT1的mRNA表达水平与冷冻人肠细胞相当或更高，但随传代表达有所下降。免疫染色证实这些转运蛋白定位于顶膜。转运实验表明，各代次细胞均保持P-gp和BCRP的活性，且可被特异性抑制剂有效抑制，证明其转运功能在长期培养中保持稳定。

器官来源肠上皮细胞具有药物代谢能力

IO-IEC表达多种细胞色素P450酶，其中CYP1A1、2C9、2C19和3A4的表达水平与冷冻人肠细胞相当或更高，CYP3A4活性比Caco-2细胞高约34倍。CES2表达与人类肠细胞相当，但不表达肝脏型CES1。细胞可被维生素D3、奥美拉唑、利福平等诱导剂激活CYP表达。毒性实验显示，IO-IEC对萘普生呈现剂量依赖性细胞毒性，对乙酰氨基酚毒性较弱，这与人体小肠对这两种药物的反应特性一致。

研究结论与意义

该研究证实，器官来源的肠上皮细胞具有高度稳定性，通过培养传代可实现同质细胞的稳定供应，通过长期培养中的自我更新维持高水平功能。这些细胞保持与Caco-2细胞相当的屏障功能、转运活性，以及与冷冻人肠细胞相当的代谢活性，使其成为药物研发中有价值的、功能更优的模型。

特别值得注意的是，增殖速率下降先于肠上皮功能丧失出现，这为定义细胞使用限提供了明确的表型标志。增殖降低的IO-IEC很可能出现功能衰退，不应再用于实验。

这项研究的重要意义在于：首先，提供了比Caco-2细胞更接近人体生理状态的肠上皮细胞模型，特别是高CYP3A4表达和CES2表达，能更准确预测药物的首过代谢；其次，建立的二维培养体系可实现细胞的大规模扩增和长期培养，解决了类器官技术在应用层面的限制；第三，细胞功能的稳定性支持其在重复给药试验和器官芯片等长期研究中的应用；最后，研究明确了细胞功能衰减的预警指标，为质量控制提供了科学依据。

该技术平台有望显著提高药物吸收、代谢和毒性预测的准确性，推动微生理系统和器官芯片技术的发展，最终加速更安全有效药物的开发进程。