唑类抗真菌药抑制CYP8B1调控胆汁酸酸性合成通路的代谢流分析及其在HepG2细胞模型中的验证

　　本研究通过三碘甲状腺原氨酸-地塞米松-苯扎贝特（TDB）诱导优化HepG2细胞模型，结合稳定同位素13C3-胆固醇示踪与LC-MS代谢流分析，首次揭示CYP8B1在酸性胆汁酸合成通路中催化胆酸生成的关键作用，并发现益康唑（ECZ）可作为选择性CYP8B1抑制剂（IC50=0.31-0.45 μM），为代谢性疾病药物研发提供新型高通量筛选平台。

　　

Highlight

Materials and Reagents

为进行反应性或结合实验，本研究使用既往方法表达并纯化了重组人CYP8B1蛋白（rCYP8B1）。其针对底物DHCA和C4的酶活性分别为172 U/mg和229 U/mg。人细胞色素P450还原酶购自Corning公司，β-NADP、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PHD）购自美仑生物。实验采用DHCA、THCA、C4、12α-C4、3β-羟基-5-胆烯酸等标准品。

Reactivity of rCYP8B1 to cholestenoic acid metabolites in the acidic pathway

目前尚不清楚CYP8B1是否参与酸性通路，即缺乏证据表明CYP8B1可催化胆烯酸中间体（如3β-HCA、3β,7α-diHCA和3O,7α-HCA）的12α-羟化反应。我们在10 μM浓度下于rCYP8B1酶中进行了它们的12α-羟化反应活性分析，并以C4、DHCA和C₂₄胆汁酸（24碳胆汁酸）作为平行对照。如图1A与图1B所示，CYP8B1表现出预期的强活性，可将DHCA转化为THCA，并将C4转化为12α-C4。

Discussion

HepG2细胞中的胆汁酸代谢与原代人肝细胞（PHHs）存在显著差异。PHHs主要通过中性通路合成胆汁酸，该通路由限速酶胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）启动。而HepG2细胞因CYP7A1表达极低，以酸性通路为主导。

Conclusion

本研究建立了一种基于¹³C₃-胆固醇代谢流分析的高通量方法，用于评估HepG2细胞中CYP8B1活性，并鉴定出益康唑（ECZ）作为相对选择性的CYP8B1抑制剂。该方法通过整合TDB-HepG2细胞中的CYP8B1活性，解决了CYP8B1抑制评价中的关键难题。与rCYP8B1实验相比，¹³C₃-胆固醇代谢流实验能更全面地反映潜在抑制剂对细胞中整体胆汁酸生物合成的影响。