通过固定化在细胞上的腈水合酶高效去除来自Ensifer adhaerens的sulfoxaflor：生物降解动力学、催化特性及生态毒性评估

《Environmental and Sustainability Indicators》：Efficient sulfoxaflor removal via cell-immobilized nitrile hydratase from Ensifer adhaerens: Biodegradation kinetics, catalytic characteristics, and ecotoxicological evaluation

　　硫氟定康（SUL）可通过根瘤菌 Ensifer adhaerens CGMCC 6315 的 nitrile hydratase 酶催化水解为酰胺代谢物 X11719474，固定化细胞在降解效率上显著优于游离细胞，且代谢物对蓝藻 Synechocystis sp. PCC 6803 的氧化损伤和光合抑制效应更强，提示需在环境风险评估中纳入代谢物毒性。

　　在现代农业中，新烟碱类杀虫剂（NENI）被广泛用于害虫防治，因其对靶标害虫的高度选择性而受到青睐。然而，随着其使用量的增加，这类农药对非靶标生物的生态风险也逐渐显现。特别是硫氟肟草（SUL）这一第四代新烟碱类杀虫剂，尽管具有较低的哺乳动物毒性和较少与其他农药交叉干扰的优点，但其高水溶性使得其在水体中的迁移性较强，容易造成广泛的水生生态系统污染。因此，研究如何有效降解这类农药及其代谢产物，对于减轻其生态影响具有重要意义。

本研究聚焦于SUL的生物降解机制，探索了一种基于微生物的修复策略。通过使用一种固氮细菌Ensifer adhaerens CGMCC 6315，研究人员发现该菌株能够通过硝基水合酶（NHase）催化反应，将SUL降解为一种更具极性的代谢产物X11719474。实验结果显示，自由状态下的Ensifer adhaerens CGMCC 6315能够在3小时内降解77.91%的0.89 mmol/L SUL，其半衰期仅为46.21分钟。而通过钙藻酸固定化处理的细胞在2小时内即可实现78.57%的SUL去除率，3小时内几乎完全消除SUL，显示出显著的降解效率。此外，固定化重组大肠杆菌Escherichia coli pET28a-PnhA在酸性耐受性、储存稳定性和重复使用性方面表现更优，这表明通过基因工程手段增强微生物的降解能力是可行的。

SUL的降解过程不仅涉及其自身，还包括其代谢产物的处理。研究表明，X11719474对水生蓝藻Synecocystis sp. PCC 6803具有更高的毒性，导致其产生显著的氧化应激反应。具体表现为超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性的暂时激活后迅速下降，同时丙二醛（MDA）水平持续上升。这些发现揭示了农药代谢产物可能被低估的生态风险，强调了在评估新烟碱类农药的环境风险时，必须考虑其转化产物的影响。

为了评估不同降解策略的效率，研究人员采用了一系列实验方法。首先，通过高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术，确认了SUL降解的主要代谢产物为X11719474。其次，利用不同固定化方法（如钙藻酸、聚乙烯醇、粉末活性炭等）对大肠杆菌pET28a-PnhA的降解能力进行了系统分析。结果显示，钙藻酸固定化的大肠杆菌在2小时内可去除78.57%的SUL，而其他固定化方法则表现出较低的降解效率。这表明，选择合适的固定化材料对于提高微生物降解效率至关重要。

此外，研究还探讨了不同pH值和温度条件对NHase活性及稳定性的影响。在pH 6.0条件下，两种细胞类型（自由细胞和固定化细胞）均表现出最高的NHase活性，但在酸性条件（pH 4.0）下，固定化细胞的活性下降更为显著。温度方面，自由细胞在60℃时达到最佳活性，而固定化细胞则在40℃时表现最佳。尽管固定化细胞在较低温度下显示出更好的稳定性，但在高温条件下（如60℃），其活性下降速度更快，说明固定化可能在一定程度上限制了酶的热稳定性。因此，优化固定化策略以提高其热稳定性是未来研究的一个重要方向。

在实际应用中，固定化细胞的储存稳定性和重复使用性同样值得关注。实验表明，固定化的大肠杆菌pET28a-PnhA在4℃储存6天后仍能保留74.01%的PnhA活性，而自由细胞仅保留58.71%。此外，固定化细胞在10次重复使用后仍保持较高的活性，显示出良好的重复使用潜力。这表明，固定化技术不仅提高了微生物的降解效率，还增强了其在实际环境中的应用价值。

然而，尽管固定化技术在提高降解效率和稳定性方面表现出色，其在复杂水体环境中的应用仍面临挑战。例如，载体材料的机械强度不足、底物传质限制以及连续系统中可能出现的生物膜堵塞问题，都需要进一步优化。因此，未来的研究应致力于开发更耐用的固定化载体，并探索如何在不同水质条件下提高降解效率。

研究还评估了不同浓度的SUL和X11719474对Synecocystis sp. PCC 6803生长、光合色素含量和氧化应激指标的影响。结果表明，X11719474对蓝藻的抑制作用比SUL更为显著，且随着浓度的增加，抑制效应逐渐增强。进一步的分析显示，SUL和X11719474均能引起蓝藻体内光合色素的合成抑制，尤其是叶绿素a（Chla）和类胡萝卜素含量的减少。同时，两种化合物均能诱导蓝藻体内超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性变化，表现出先升高后下降的趋势。此外，丙二醛（MDA）水平的持续上升表明了氧化损伤的加剧，进一步支持了X11719474在生态毒性方面的更高风险。

综上所述，本研究不仅揭示了SUL及其代谢产物X11719474在水生生态系统中的潜在毒性，还提出了一个高效的固定化细胞生物修复平台。该平台在降解SUL方面表现出色，同时对代谢产物的生态风险进行了深入分析。这些发现对于制定更全面的农药环境风险评估体系具有重要意义，也为未来开发更环保的农药管理策略提供了科学依据。