辐射诱导的癌相关成纤维细胞胞外囊泡通过miR-193a-3p/PTEN/Akt通路驱动食管鳞癌转移的机制与临床意义

　　本研究揭示了放疗后食管鳞癌（ESCC）复发转移的新机制：辐射激活的癌相关成纤维细胞（CAFs）通过分泌富含miR-193a-3p的胞外囊泡（EVs），经PTEN/Akt信号通路促进肿瘤细胞上皮-间质转化（EMT）和转移。该发现为改善ESCC放疗疗效提供了新的靶向策略，血浆外泌体miR-193a-3p可作为潜在预后标志物。

　　

研究背景

食管鳞状细胞癌（ESCC）是全球癌症相关死亡的第六大原因，其中约90%的食管癌病例为ESCC。放疗在局部晚期ESCC的治疗中扮演关键角色，但超过50%的患者在两年内出现远处复发。放疗不仅直接杀伤肿瘤细胞，还会改变肿瘤微环境（TME），可能促进免疫逃逸。癌相关成纤维细胞（CAFs）作为TME中的关键非免疫组分，通过支持肿瘤生长在癌症进展中发挥重要作用。然而，CAFs在放疗后ESCC复发中的作用尚不明确。

材料与方法

研究采用KYSE150 ESCC细胞与未辐射（0 Gy）或辐射（8 Gy）处理的CAFs共植入裸鼠体内。通过差速离心法分离CAF来源的胞外囊泡（EVs），并采用电镜和免疫印迹进行鉴定。Transwell实验评估EVs对ESCC细胞迁移和侵袭的影响。RNA测序识别差异表达的microRNAs，功能实验验证miR-193a-3p的作用。分析32例ESCC患者血浆样本和76例患者组织样本中miR-193a-3p的表达。

辐射后CAFs来源的EVs促进ESCC转移

体内实验显示，辐射处理的CAFs显著促进ESCC细胞的肺转移（7/10 vs. 1/10）。体外实验表明，辐射CAFs的条件培养基（CM）增强ESCC细胞的侵袭和迁移能力，且该效应可被EV分泌抑制剂GW4869消除。透射电镜和纳米颗粒追踪分析证实EVs的结构特性，Western blot检测到EV标志物（CD63、TSG101和CD9）。功能分析显示，辐射CAFs来源的EVs（CAF_{8 Gy}-EVs）比未辐射CAFs来源的EVs（CAF_{0 Gy}-EVs）更能促进ESCC细胞迁移和侵袭。体内肺转移模型中，CAF_{8 Gy}-EVs处理显著增加转移结节数量。此外，CAF_{8 Gy}-EVs处理上调间质标志物（Vimentin和Snail）表达，下调上皮标志物E-cadherin表达，表明促进上皮-间质转化（EMT）。

miR-193a-3p在辐射CAFs来源的EVs中上调并可转移至ESCC细胞

miRNA测序显示，CAF_{8 Gy}-EVs中miR-193a-3p和miR-197-3p表达显著上调。qPCR验证miR-193a-3p在CAF_{8 Gy}-EVs中表达增加超过10倍。辐射后CAFs细胞内miR-193a-3p水平显著升高，而ESCC细胞中无此变化。ESCC细胞经CAF_{8 Gy}-EVs或CAF_{8 Gy}-CM处理后，细胞内miR-193a-3p表达升高。使用RNase和Triton X-100处理或GW4869抑制EVs生成和分泌后，miR-193a-3p水平降低，表明miR-193a-3p以EV依赖方式转移。TGF-β/Smad通路抑制剂SB431542完全消除辐射诱导的miR-193a-3p上调，而MEK/ERK通路抑制剂U0126无影响，提示TGF-β/Smad通路介导辐射诱导的miR-193a-3p上调。

辐射CAFs来源的EV miR-193a-3p促进ESCC转移和EMT

过表达miR-193a-3p增强ESCC细胞迁移、侵袭能力和EMT标志物表达。敲低CAFs中miR-193a-3p后，辐射CAFs来源的EVs无法促进ESCC细胞侵袭、迁移或EMT。体内实验进一步证实，敲低miR-193a-3p的CAFs与KYSE150细胞共植入后，肿瘤体积减小，肺转移减少，PTEN和E-cadherin表达增加，p-Akt和Snail表达降低。

miR-193a-3p通过PTEN/Akt介导的EMT促进ESCC转移

生物信息学分析预测PTEN为miR-193a-3p的靶基因。荧光素酶报告实验验证miR-193a-3p与PTEN 3'UTR的结合。miR-193a-3p过表达降低PTEN表达并增加p-Akt水平，而抑制miR-193a-3p则相反。PTEN敲低增强ESCC细胞侵袭、迁移和EMT，PTEN过表达逆转miR-193a-3p mimics或CAF_{8 Gy}-EVs的促迁移和促侵袭效应。Akt抑制剂MK-2206减弱miR-193a-3p诱导的ESCC细胞侵袭、迁移和EMT标志物变化。

CAFs来源的miR-193a-3p–PTEN–Akt轴在局部放疗后调控ESCC转移和EMT

体内实验显示，敲低miR-193a-3p的CAFs与KYSE150细胞共植入后，局部辐射（6 Gy）导致肿瘤体积减小，无肺转移发生（0/10），而对照组5/10发生转移。免疫组化和Western blot显示，敲低组PTEN和E-cadherin表达增加，p-Akt和Snail表达降低。

miR-193a-3p上调与ESCC患者不良预后相关

76例ESCC患者组织样本中，miR-193a-3p高表达与晚期T分期、N分期和TNM分期显著相关。Kaplan-Meier生存曲线显示，miR-193a-3p高表达患者无病生存（DFS）、远处转移免费生存（DMFS）和总生存（OS）较短。多因素Cox回归分析确认miR-193a-3p为ESCC患者不良预后的独立预测因子。前瞻性队列中，32例接受确定性放化疗的ESCC患者血浆EV miR-193a-3p水平在放疗后14天显著升高。

讨论

放疗是ESCC治疗的基石，但远处复发仍是主要挑战。辐射通过改变TME影响肿瘤进展，其中CAFs作为关键组分，其辐射后激活促进肿瘤转移。本研究首次证实辐射CAFs通过EVs介导细胞间通讯，携带miR-193a-3p至ESCC细胞，抑制PTEN并激活Akt信号，增强EMT和转移能力。临床数据支持miR-193a-3p作为预后标志物的潜力，靶向该通路可能改善放疗疗效。