5-羟基阿魏酸的多靶点抗氧化与抗炎机制：体外与计算机模拟的综合研究揭示其治疗潜力

　　本研究通过体外实验和计算机模拟系统评估了5-羟基阿魏酸（5-OHFA）的生物学活性。结果表明，相较于阿魏酸（FA），5-OHFA展现出显著增强的抗氧化（DPPH、ABTS、FRAP、Fe2+螯合）、抗炎（蛋白质变性抑制）和抗溶血能力，且具有优良的药代动力学特性（ADMET）和低毒性。分子对接揭示其与关键靶点（NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、环氧合酶-2、5-脂氧合酶、髓过氧化物酶、EGFR）的强结合亲和力，支持其作为多功能天然化合物在氧化应激和炎症相关疾病治疗中的潜力。

　　

引言

天然产物因其结构多样性和广泛的生物活性，在药物发现中始终占据重要地位。酚酸作为其中一类重要化合物，在调节氧化应激和炎症相关的生化通路中表现出显著潜力。阿魏酸（FA）作为一种研究广泛的酚酸，具有抗氧化、抗炎、抗癌和抗菌活性。近年来，研究人员致力于通过结构修饰提升FA的物化与生物学特性，其中5-羟基阿魏酸（5-OHFA）作为FA的羟基化衍生物，因其在芳香环5号位增加了一个羟基，被认为可改善亲水性、电子供给能力和自由基稳定化潜能，进而增强抗氧化活性。然而，5-OHFA的药理学特征，尤其是其抗炎、抗溶血活性及与关键氧化和炎症酶靶点的相互作用机制，尚未得到系统研究。

材料与方法

研究使用高纯度5-OHFA（≥98%），通过一系列体外抗氧化实验（DPPH、ABTS、FRAP、Fe²⁺螯合）和抗炎评估（蛋白质变性试验），并结合计算机模拟（SwissADME、ProTox-III、分子对接）进行全面分析。抗氧化活性通过测定IC₅₀值进行评估；抗炎潜力通过牛血清 albumin（BSA）和蛋清蛋白变性抑制实验验证；抗溶血活性通过热诱导溶血实验测定；细胞毒性使用MTT法在五种人源细胞系（HCT116、LS174T、WM266-4、MCF-7、HEK293）上进行测试。

结果

DPPH自由基清除活性

5-OHFA展现出强烈的抗氧化活性，其IC₅₀值为11.89±0.20 μM，显著优于FA的66±2.30 μM。在最高测试浓度23.78 μM下，清除率达到99.70%，呈现明显的剂量依赖性。

ABTS⁺清除活性

5-OHFA的IC₅₀值为9.51±0.15 μM，优于FA及异阿魏酸（IFA）。抑制率从12%（2 μM）增至74%（18 μM），拟合指数R²=0.9862，显示良好的剂量-效应关系。

Fe²⁺螯合 assay

5-OHFA的螯合能力从1%（2 μM）增至62%（55 μM），IC₅₀为36.31±1.36 μM，显著强于FA的270.27±1.14 μM，突显其优异的金属离子螯合特性。

FRAP assay

5-OHFA的还原能力IC₅₀为5.94±0.09 μM，吸光度从0.84（1 μM）升至1.895（14 μM），表明其作为电子供体的有效性，支持其通过还原机制中和氧化物种。

体外抗炎潜力

在BSA变性实验中，5-OHFA在25 μg/mL浓度下抑制70%变性，IC₅₀为15 μg/mL，虽低于双氯芬酸的97%抑制率和2.5 μg/mL IC₅₀，但仍显示显著活性。在蛋清蛋白变性实验中，5-OHFA在200 μg/mL时抑制73%变性，IC₅₀为125 μg/mL，与双氯芬酸（88%，112.5 μg/mL）效果接近。

热诱导溶血

5-OHFA在0.5-50 mM浓度范围内仅显示轻度溶血活性，最高浓度下溶血率为47.5%，IC₅₀为23.78±1.48 mM，表明其能有效保护红细胞膜完整性，可能归因于其自由基清除特性抑制脂质过氧化。

体外抗癌活性

5-OHFA对HCT116细胞显示接近50%的生长抑制，但对LS174T无抑制效果。对MCF-7和WM266-4细胞的抑制率分别为16.73±2.46%和28.28±2.08%，均低于他莫昔芬的抑制率（79.56±2.17%和76±1.96%），表明其抗癌活性具有选择性。

计算机模拟分析

ADMET预测

5-OHFA分子量为210.19 g/mol，符合Lipinski五规则，log P值显示适当亲脂性，TPSA值提示良好口服生物利用度。BOILED-Egg模型预测其具有高胃肠道吸收和低血脑屏障通透性。ProTox-II预测LD₅₀为1772 mg/kg，属低至中度毒性，无显著肝毒性，整体安全 profile 良好。

分子对接与结构-活性关系

5-OHFA与多种关键酶靶点显示更强的结合亲和力：NADPH氧化酶（-6.1 vs. -5.9 kcal/mol）、黄嘌呤氧化酶（-7.0 vs. -5.6 kcal/mol）、环氧合酶-2（-5.8 vs. -5.7 kcal/mol）、5-脂氧合酶（-6.1 vs. -6.2 kcal/mol）、髓过氧化物酶（-5.0 vs. -4.8 kcal/mol）和EGFR（-5.9 vs. -5.8 kcal/mol）。额外的羟基使5-OHFA形成更多氢键、π-π堆积和疏水相互作用，例如与NADPH氧化酶的THR9和HIS79残基、黄嘌呤氧化酶的THR1083、ALA1079和SER1080残基等，增强了结合稳定性和抑制潜力。与EGFR的对接显示，5-OHFA通过氢键（Lys721、Leu765、Met769）、π-烷基相互作用（Val702、Ala719）等多种方式结合，结合能（-5.9 kcal/mol）与他莫昔芬（-7.3 kcal/mol）相当，提示其作为EGFR抑制剂的潜力。

讨论

5-OHFA由于其芳香环5号位的额外羟基，显著提升了自由基清除、金属螯合和还原能力，抗氧化和抗炎活性均优于FA。其抗溶血和细胞保护作用可能与抑制脂质过氧化和稳定细胞膜相关。分子对接结果证实了其与氧化应激和炎症关键酶的多靶点强效结合，支持其作为多功能调节剂的潜力。5-OHFA具备良好的药代动力学特性和低毒性，适合口服和局部给药，但中枢神经系统渗透性低，适合外周应用。选择性抗癌活性提示其可能用于靶向治疗，未来可通过结构优化（如酯化或烷基化）进一步增强活性。

结论

5-OHFA作为一种羟基化FA衍生物，展现出卓越的抗氧化、抗炎、抗溶血和选择性细胞毒性，其多靶点作用机制和良好的药物特性支持其在医药和营养保健品开发中的潜力。当前研究的局限性在于与FA的对比数据来自文献而非平行实验，未来需进行直接比较和体内验证，以全面评估其治疗价值。