阿根廷淡水环境中携带CARB型β-内酰胺酶的非O1/非O139霍乱弧菌的基因组分析与毒力特征研究

　　本研究系统分析了阿根廷科尔多瓦省淡水环境中分离的非O1/非O139霍乱弧菌，发现其普遍携带新型CARB型β-内酰胺酶（CARB-59至CARB-62），揭示了这些环境菌株作为抗生素耐药基因库的重要生态角色。特别值得注意的是，研究发现某些菌株携带独特的VPI-1毒力岛遗传结构，同时编码TCP菌毛和T6SS（Ⅵ型分泌系统）i5亚类，显著增强了菌株的肠道毒素产生能力。这些发现为理解环境菌株的耐药性进化（CARB β-内酰胺酶）和致病潜力（ctxA阴性但携带hlyA、rtx、chxA等毒素基因）提供了重要见解，凸显了（One Health）框架下环境微生物在抗菌素耐药性传播中的关键作用。

　　

1 引言

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是一种广泛分布于全球水生生态系统的革兰阴性弧菌。根据脂多糖O抗原的差异，该菌被分为200多种血清群，其中O1和O139是引起霍乱大流行的病原体，主要因其表达霍乱毒素（CT）和毒素共调节菌毛（TCP）等关键毒力因子。而非O1/非O139血清群通常不产生CT，但仍可导致腹泻等疾病，并被认为是河流、湖泊和海洋中抗生素耐药性的重要储存库。理解这些菌株的遗传耐药性和毒力特征，对于揭示其在抗菌素耐药性传播和致病性中的作用具有重要意义。

抗菌素耐药性已成为当今人类健康面临的重大挑战。据估计，2021年因抗菌素耐药性导致的死亡人数达114万，且预计2025至2050年间死亡人数将达3910万。这一严峻形势要求我们采取综合性的“One Health”策略，从人类、动物、微生物和环境相互作用的视角全面理解抗菌素耐药性。在此背景下，环境抗菌素耐药性，尤其是水生生态系统中自由生活细菌所携带的耐药性，仍存在显著认知空白。霍乱弧菌作为一种高度适应水环境的细菌，可能是环境中抗生素耐药基因的重要储存库，且其基因组可塑性高，能够通过质粒、整合性接合元件（ICE）、I类整合子和霍乱弧菌超级整合子等移动元件进行遗传交换。

2 实验方法

2.1 菌株来源

本研究共纳入60株非O1/非O139霍乱弧菌，这些菌株于1991至1994年间从阿根廷科尔多瓦省的16个淡水水体中分离获得，保存于CIBICI-CONICET的霍乱弧菌库。此外，还包含2株不产CT的非O1/非O139临床分离株和1株产CT的O1 El Tor临床分离株作为对照。

2.2 抗菌药物敏感性试验

采用纸片扩散法测定所有环境分离株对氨苄西林、庆大霉素、四环素、环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑和氯霉素的敏感性，并依据CLSI标准进行判读。对氨苄西林耐药及部分敏感菌株进一步采用琼脂稀释法测定对多种β-内酰胺类药物（包括含酶抑制剂的复合制剂）的最低抑菌浓度（MIC）。

2.3 等电聚焦

采用分析性等电聚焦技术测定氨苄西林耐药菌株的β-内酰胺酶等电点，使用已知pI值的PER-2（pI 5.4）和CTX-M-2（pI 7.9）作为标准参照。

2.4 毒力基因PCR检测

通过PCR检测hlyA（弧菌溶素）、toxR（毒力调节因子）、ctxA（CT A亚单位）、tcpA（TCP主要结构亚单位）、ace（辅助霍乱肠毒素）和zot（ zonula occludens毒素）等毒力基因。

2.5 全基因组测序

对所有氨苄西林耐药菌株（n=10）进行全基因组测序，使用Illumina Novaseq 6000平台进行150 bp双端测序。

2.6 序列质量与控制

使用Trimmomatic对测序 reads进行质控，FastQC评估质量，SPAdes进行从头组装，QUAST评估组装质量，CheckM检查基因组纯度。

2.7 多位点序列分型

通过rMLST进行物种确认，利用pubMLST数据库提供的方案（基于adk、gyrB、mdh、metE、pntA、purM和pyrC等7个看家基因）进行MLST分型。

2.8 耐药组、毒力组和质粒分析

使用AMRFinderPlus和ARIBA识别抗生素耐药基因（包括bla_CARB等位基因），利用VFDB和VFanalyzer鉴定毒力基因，通过Plasmidfinder评估质粒复制子存在情况。

2.9 bla_CARB等位基因鉴定与遗传环境分析

新发现的bla_CARB等位基因提交NCBI登记，利用Clustal Omega进行多序列比对和系统发育分析，通过NCBI ORF Finder和BLASTN分析bla_CARB的遗传环境。

2.10 泛基因组与系统发育分析

使用Bakta进行基因组注释，利用PanX进行泛基因组分析，基于核心基因组SNP使用IQ-TREE构建最大似然系统发育树，并通过FastBAPS进行种群结构分析。

2.11 兔肠袢实验

采用兔肠袢实验评估菌株的肠毒素产生能力，以PBS为阴性对照，以产CT的O1 El Tor菌株和非致病性大肠杆菌DH5α分别作为阳性和阴性对照。

3 结果

3.1 环境非O1/非O139霍乱弧菌的起源、毒力基因和耐药表型

60株菌株均不携带ctxA、ace、zot和tcpA基因，但全部携带toxR和hlyA基因。药敏试验显示，16%的菌株（10株）对氨苄西林耐药，且这是唯一检测到的耐药表型。

3.2 氨苄西林耐药菌株的基因组分析鉴定出新型CARB β-内酰胺酶变异体

全基因组测序证实10株氨苄西林耐药菌株均携带CARB β-内酰胺酶基因。其中2株携带已知的bla_CARB-7，其余8株携带4种新型变异体，被命名为bla_CARB-59（VC41）、bla_CARB-60（VC12、VC36、VC77、VC92、VC95）、bla_CARB-61（VC84）和bla_CARB-62（VC58）。这些新变异体与bla_CARB-7和bla_CARB-9高度同源（核苷酸一致性97.0%–99.9%）。系统发育分析显示，它们与来自阿根廷的CARB-7和CARB-9亲缘关系最近，共同形成一个独立进化分支。MIC测定显示，携带bla_CARB的菌株对氨苄西林和替卡西林的MIC值显著升高（32-512 μg/mL），且克拉维酸可使其MIC降低16-128倍，这与CARB酶的特性一致。等电聚焦显示这些β-内酰胺酶的pI值在5.2-5.4之间。

3.3 bla_CARB等位基因侧翼具有霍乱弧菌重复序列（VCR），提示其与霍乱弧菌超级整合子相关

序列分析发现，所有bla_CARB基因均被VCR序列侧翼，这与霍乱弧菌超级整合子的结构特征一致。其中，VC97的contig上有11个预测ORF（包括bla_CARB-7）被VCRs侧翼，强烈表明这些基因位于超级整合子内。

3.4 携带bla_CARB的环境霍乱弧菌菌株的毒力特征

毒力组分析显示，所有菌株均携带MSHA和ChiRP菌毛（msh, pil）、铁获取系统（vib, irgA, vctA, viuPDGC等）、鞭毛生物合成全套基因、荚膜合成基因、群体感应系统（cqsA, luxS, hapR）以及T2SS（eps, gspD）和T6SS（vas, vgrG, hcp, vip）基因。所有菌株均不携带ctxAB但均携带hlyA、rtxABCD（RTX毒素）和tlh（不耐热溶血素）。多数菌株携带cholix外毒素基因（toxA/chxA），4株菌携带热稳定肠毒素基因（stn/NAG-ST）。值得注意的是，VC92和VC95（ST1563）携带了VPI-1毒力岛，该岛编码TCP菌毛和一个T6SS大簇（亚类i5）。这种VPI-1内携带T6SS i5的遗传结构较为罕见，此前仅在 Haiti的2010V-116株和中国ICDC-VC702株中有报道。此外，这两株菌在另一染色体位置还携带一个T6SS i1亚类簇。兔肠袢实验证实，VC92和VC95能引起显著的液体蓄积，其肠毒素活性与引起霍乱样腹泻的临床分离株相当。

3.5 霍乱弧菌菌株的系统发育分析

对46株霍乱弧菌（包括本研究的9株bla_CARB阳性株）的核心基因组进行系统发育分析，结果显示菌株具有高度遗传多样性。FastBAPS算法将其分为5个簇，其中 Cluster I 包含了本研究中7株bla_CARB阳性株以及来自美国和日本的4株bla_CARB阳性株，表明该簇可能与获得bla_CARB的能力有关。VC97和VC58分别位于Cluster II和V。所有O1血清群菌株单独成簇（Cluster IV）。

4 讨论

本研究发现氨苄西林耐药是阿根廷环境非O1/非O139霍乱弧菌中最普遍的耐药表型，且由CARB β-内酰胺酶介导。这一现象在人为β-内酰胺压力较小的环境中显得尤为有趣。研究发现的新型CARB变异体（CARB-59至CARB-62）与超级整合子关联，支持了其作为基因盒被超级整合子捕获的假说。菌株携带丰富的毒力基因库（hlyA, rtx, chxA, stn等），但无ctxAB和III型分泌系统基因。特别重要的是，VC92和VC95不仅高度同源（0 SNP），且携带独特的VPI-1结构（含TCP和T6SS i5），并表现出更强的肠毒素活性，揭示了环境菌株获得关键毒力岛并增强致病性的潜力。

5 结论

本研究详细描述了阿根廷科尔多瓦省淡水环境中非O1/非O139霍乱弧菌的遗传多样性、抗菌素耐药性和毒力潜能。氨苄西林耐药由新型CARB β-内酰胺酶（CARB-59至CARB-62）介导，这些基因很可能位于超级整合子内。某些菌株携带独特的VPI-1毒力岛排列，同时编码TCP和T6SS i5，与其增强的毒力相关。总之，环境非O1/非O139霍乱弧菌可作为耐药和毒力基因的储存库，通过基因交换增强其遗传多样性、生态适应性和致病潜力。