葛根素通过多靶点调控炎症、凋亡与细胞外基质降解延缓骨关节炎进程

　　本研究深入探讨了天然异黄酮化合物葛根素（PUE）在骨关节炎（OA）治疗中的多靶点作用机制。通过整合生物信息学分析、分子对接、体外实验及体内模型，研究发现PUE能有效抑制炎症因子（如TNF-α、IL-6）、减少软骨细胞凋亡（调控BCL-2/BAX/caspase-3通路），并逆转IL-1β诱导的细胞外基质降解（上调Aggrecan/Collagen II，下调MMP-13/ADAMTS5）。其核心机制涉及激活PI3K-AKT信号通路，并在DMM小鼠模型中显著延缓OA进展。该研究为PUE作为疾病修饰剂治疗OA提供了扎实的理论与实验依据，具有重要的临床转化潜力。

　　

3.1 葛根素治疗骨关节炎的生物信息学分析

为探究葛根素（PUE）治疗骨关节炎（OA）的潜在分子机制，研究团队首先通过SwissTargetPrediction数据库预测PUE的潜在靶点，获得39个候选靶蛋白。同时从GeneCards数据库筛选出5526个OA相关基因，交叉比对后鉴定出57个重叠靶点，提示PUE可能通过多靶点相互作用模式调控OA进程。基因本体（GO）富集分析显示，这些靶点显著富集于胶原代谢与分解过程、细胞外基质（ECM）组织及结缔组织结构完整性等生物学过程。蛋白质相互作用（PPI）网络分析进一步识别出BCL2、PTGS2、MMP9、HIF1A和AKT1等核心枢纽基因，这些蛋白在OA微环境中的炎症反应、细胞凋亡和基质重塑过程中发挥关键调控作用。

3.2 葛根素对软骨细胞的安全浓度筛选

通过CCK-8法检测不同浓度PUE（0–100 μM）处理软骨细胞24、48和72小时后的细胞活性。结果显示，50和100 μM浓度在24和48小时显著抑制细胞活力，而20 μM在72小时也表现出细胞毒性。浓度在2.5、5和10 μM时则未观察到明显毒性作用。因此，后续体外实验选择5和10 μM作为PUE的安全有效浓度。

3.3 葛根素抑制IL-1β诱导的细胞外基质降解

研究通过免疫荧光和Western blot技术评估PUE对白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的ECM降解的影响。结果显示，IL-1β刺激显著降低Aggrecan和Collagen II的表达，并上调基质降解酶MMP-13和ADAMTS5的水平。而PUE处理可剂量依赖性地逆转这些变化，促进ECM合成并抑制其分解，表明PUE在炎症条件下具有保护软骨基质完整性的能力。

3.4 葛根素减轻IL-1β诱导的软骨细胞凋亡

研究人员通过免疫荧光、Western blot和TUNEL染色多维度评估PUE的抗凋亡作用。IL-1β刺激导致抗凋亡蛋白BCL-2表达下降，凋亡标志物cleaved caspase-3和BAX表达上升，TUNEL阳性细胞比例显著增加。PUE干预后，BCL-2水平得以恢复，cleaved caspase-3和BAX表达下降，凋亡细胞比例减少，说明PUE通过调控内源性凋亡通路保护软骨细胞。

3.5 葛根素调控IL-1β诱导的炎症反应

实时荧光定量PCR、ELISA和免疫荧光结果显示，IL-1β显著提升炎症介质TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2的mRNA和蛋白表达水平，以及前列腺素E2（PGE2）和一氧化氮（NO）的释放。PUE处理则剂量依赖性地抑制这些因子的表达和分泌，凸显其强大的抗炎能力。

3.6 分子对接及PUE对PI3K-AKT通路的调控机制

KEGG通路富集分析提示PI3K-AKT信号通路是PUE潜在作用机制中的核心通路。分子对接显示PUE与PI3K（PDB: 4OVU）和AKT（PDB: 4EJN）的活性位点残基（如ILE-634、MET-682、ASP-761和LYS-14、ARG-23、GLY-16）形成稳定氢键和疏水相互作用，结合能较低，表明其具有良好的结合亲和力。Western blot结果进一步证实，IL-1β抑制了PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平，而PUE处理可逆转这一效应，激活PI3K-AKT-mTOR信号轴，从而发挥抗炎和抗凋亡作用。

3.7 葛根素在DMM诱导的小鼠OA模型中延缓疾病进展

通过内侧半月板失稳（DMM）手术构建小鼠OA模型，并设置对照组、DMM组、DMM+PUE（50 mg/kg）和DMM+PUE（100 mg/kg）组。Micro-CT扫描显示，PUE治疗显著减少骨赘形成、改善骨体积分数（BV/TV）。组织学染色（H&E和Safranin O/Fast Green）显示PUE组软骨结构更完整，OARSI评分降低，软骨下骨板厚度增加。免疫组化和TUNEL染色进一步表明，PUE促进软骨中Aggrecan表达，并减少软骨细胞凋亡。这些体内实验一致证明PUE能有效延缓OA的结构性进展。

综上所述，葛根素通过多靶点、多通路协同作用，显著抑制炎症反应、减少细胞凋亡、促进ECM合成，并激活PI3K-AKT信号通路，在体外和体内模型中均表现出良好的软骨保护作用和疾病修饰潜力，为开发OA治疗新策略提供了重要依据。