EGFL9通过EGFR/PI3K/AKT信号通路及氨基酸代谢调控肝癌生长与转移的机制研究

　　本研究针对肝细胞癌（HCC）中EGFL9的功能机制展开深入探索。研究人员通过多组学分析及功能实验，首次揭示EGFL9通过激活EGFR/PI3K/AKT信号通路并调控丝氨酸（Ser）、蛋氨酸（Met）等关键氨基酸代谢，显著促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭。该发现为HCC诊断提供了新型血清标志物（AUC=0.834），并为靶向治疗提供了潜在新策略。

　　

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球第六大常见癌症和第三大癌症死亡原因，其治疗面临早期诊断困难、高转移率和高复发率的严峻挑战。尽管手术切除、介入治疗和靶向药物（如仑伐替尼、瑞戈非尼）不断进步，以及免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1抑制剂）的应用，患者总体获益仍有限。因此，探索新的治疗靶点和诊断标志物成为当前研究的迫切需求。

表皮生长因子样（EGFL）家族蛋白在肿瘤发生发展中扮演重要角色。已知EGFL7和EGFL8在HCC中具有促癌作用，但EGFL9（又称DLK2）在HCC中的功能尚不明确。既往研究显示，EGFL9在乳腺癌和黑色素瘤中通过调控Notch信号通路或cMET通路影响肿瘤进展，但其在HCC中的作用机制仍有待揭示。

为此，Li Ziye等研究人员在《Discover Oncology》发表了题为“EGFL9 regulates the growth and metastasis of hepatocellular carcinoma through EGFR/PI3K/AKT signaling pathway and amino acid modulation”的研究论文，系统探讨了EGFL9在HCC中的表达特征、功能作用及分子机制。

本研究主要采用以下关键技术方法：

1. 1.
   使用RT-qPCR、Western blot和免疫组化检测EGFL9在HCC组织、细胞系及血清中的表达；
2. 2.
   通过shRNA敲低和过表达慢病毒构建稳定细胞系，结合MTT、凋亡检测、划痕愈合和Transwell实验评估细胞表型；
3. 3.
   利用裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射模型验证体内肿瘤生长和转移；
4. 4.
   采用转录组、蛋白组和代谢组学进行多维度机制探索；
5. 5.
   通过抑制剂（GW2974和MK2206）处理及氨基酸剥夺实验进行功能挽救验证。

3.1 Increased expression of EGFL9 in HCC tissues, cell lines and serum

研究发现，EGFL9在HCC组织中的mRNA和蛋白表达均显著上调，67.5%（27/40）的癌组织呈现中强阳性染色，且表达水平与TNM分期、肿瘤结节数量、包膜完整性和静脉侵犯密切相关。血清ELISA显示HCC患者EGFL9水平显著高于健康对照，ROC曲线分析表明其作为诊断标志物的AUC达0.834，最佳截断值为33.33 pg/ml（敏感性82.14%，特异性85.29%）。此外，在高转移潜能细胞系（如SNU-449、JHH-7）中EGFL9表达更高，提示其与HCC恶性进展相关。

3.2 The role of EGFL9 in proliferation, migration, invasion, and apoptosis in Huh-7 HCC cells

通过构建EGFL9敲低和过表达的Huh-7细胞系，功能实验表明：EGFL9过表达显著促进细胞增殖、迁移和侵袭，并轻微抑制凋亡；而敲低EGFL9则相反，凋亡率显著上升。这表明EGFL9在维持HCC细胞低凋亡率和高恶性表型中起关键作用。

3.3 EGFL9 dual-target experiment in SNU-449 HCC cells

在SNU-449细胞中采用双靶点shRNA敲低EGFL9，进一步验证了其促增殖和抗凋亡作用，且不同靶点敲低均一致抑制细胞迁移和侵袭能力，证实了EGFL9功能的普适性。

3.4 EGFL9 promotes tumor growth and metastasis in nude mice

体内实验显示，敲低EGFL9的JHH-7细胞在裸鼠皮下成瘤体积和重量显著减小，尾静脉注射后肺转移灶数量（3 vs. 6）和肾转移灶数量（14 vs. 16）也减少，尽管肾转移差异未达统计学意义。这表明EGFL9在体内同样促进HCC生长和转移。

3.5 Transcriptomic and proteomic integrated analysis suggests EGFL9 May act through the PI3K-AKT signaling pathway and modulating the metabolism of amino acids

多组学整合分析发现，EGFL9敲低后差异表达基因显著富集于PI3K-AKT信号通路和氨基酸生物合成通路。KEGG分析提示EGFL9可能通过激活PI3K-AKT通路和调控氨基酸代谢发挥功能。

3.6 EGFL9 plays its role by modulating the levels of amino acids

代谢组学检测发现，EGFL9敲低导致丝氨酸（Ser）、蛋氨酸（Met）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）和组氨酸（His）水平下降。氨基酸剥夺实验证实，缺乏Ser、Met或His可逆转EGFL9过表达所致的增殖和迁移增强，其中Ser缺失效应最显著。这表明EGFL9通过调控这些关键氨基酸代谢促进HCC进展。

3.7 EGFL9 exerts its function through the PI3K-AKT pathway by activating EGFR

Western blot显示EGFL9过表达增强EGFR、PI3K和AKT磷酸化，而敲低则相反。使用EGFR抑制剂GW2974或AKT抑制剂MK2206处理，均可逆转EGFL9过表达引起的增殖和迁移增强。此外，EGFL9未显著激活ERK或cMET通路，表明其作用主要通过EGFR/PI3K/AKT轴介导。

结论与意义

本研究首次全面揭示了EGFL9在HCC中的致癌作用：它通过激活EGFR/PI3K/AKT信号通路和调控氨基酸代谢（尤其是Ser、Met、His等），促进肿瘤增殖、侵袭和转移。血清EGFL9水平显示出良好的诊断价值，为HCC无创诊断提供了新标志物。从治疗角度看，靶向EGFL9或其下游通路（如使用EGFR或AKT抑制剂）可能成为HCC治疗的新策略。此外，多组学方法的整合应用为肿瘤机制研究提供了范本，强调了代谢重编程在肿瘤进展中的关键作用。