大数据分析揭示miR-874在子宫内膜异位症向卵巢癌进展中的抑癌作用及治疗靶点价值

　　本研究针对子宫内膜异位症(EMS)显著增加卵巢癌风险但分子机制不明的临床难题，通过整合多组学大数据分析，系统探讨了miR-874在EMS相关透明细胞卵巢癌(CCOC)中的调控作用。研究发现EMS是CCOC的关键风险因素，miR-874下调通过调控ZNF217-MTBP-MDM2-p53信号轴促进肿瘤进展，同时改变肿瘤微环境组成。该研究为EMS相关CCOC的分子 pathogenesis 提供了新见解，并为开发预后标志物和治疗靶点奠定了理论基础。

　　

子宫内膜异位症(Endometriosis, EMS)是一种常见的慢性妇科疾病，影响着约5%-10%的育龄期女性。这种疾病的特点是子宫内膜样组织出现在子宫腔外，并对卵巢激素的周期性变化保持反应性，导致周期性出血、慢性炎症和纤维化，引起慢性盆腔疼痛和不育等症状。虽然EMS通常被认为是良性疾病，但慢性炎症、组织增生和异位子宫内膜组织的异常行为可能会增加某些肿瘤的风险。值得注意的是，患有EMS的女性发生卵巢癌的风险显著增加，研究表明其风险约为普通人群的三倍。

在卵巢癌的各种亚型中，透明细胞卵巢癌(Clear Cell Ovarian Carcinoma, CCOC)是临床治疗挑战性大、预后差的亚型。CCOC占所有卵巢恶性肿瘤的5-25%，其死亡率在所有卵巢癌中排名第二，5年生存率约为50%。研究表明EMS是CCOC的重要风险因素之一。尽管有证据表明某些卵巢癌，特别是CCOC和子宫内膜样卵巢癌(Endometrioid Ovarian Cancer, EOC)，可能从EMS演变而来，但这种进展的确切分子机制仍不清楚。

近年来，随着基因组学、转录组学和大数据分析技术的发展，许多疾病的遗传背景和分子机制得到了前所未有的深入研究。特别是全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies, GWAS)在揭示疾病遗传因素方面取得了显著进展。通过利用GWAS数据库的大规模遗传数据，并结合孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)分析，为推断疾病间的因果关系提供了有力证据。

血液被认为是反映体内各器官状态的液体环境，在疾病的发生、诊断、预后和治疗中起着至关重要的作用。其中一个新兴关注领域是microRNAs(miRNAs)的作用，这些小的非编码RNA通过结合信使RNAs(mRNAs)并抑制其翻译或促进其降解来调节基因表达。MiRNAs参与各种生物过程，包括细胞生长、分化、凋亡和癌症进展。在EMS和卵巢癌的背景下，miRNAs可能作为肿瘤发生的关键调节因子，影响驱动良性子宫内膜异位病变向恶性卵巢肿瘤转化的细胞过程。

研究人员发现miR-874可能是EMS向CCOC进展的分子联系。miR-874是一种在包括卵巢癌在内的多种癌症中失调的microRNA，已成为这种转化的潜在贡献者。最近的研究表明，miR-874在卵巢癌组织中下调，其表达减少可能与肿瘤进展和不良预后相关。然而，miR-874介导从EMS向CCOC转变的具体分子机制仍然知之甚少。

在《Discover Oncology》发表的这项研究中，研究人员整合多个数据集来探索从EMS向CCOC转变的分子机制，重点关注miR-874的作用。研究发现miR-874在EMS和CCOC中持续显著下调，其表达减少与不良预后相关。生物信息学分析和初步实验证据表明，miR-874下调与ZNF217的上调相关，这反过来可能促进MTBP过表达并增强MDM2稳定性，最终抑制p53信号传导并促进肿瘤进展。这些发现为EMS和CCOC之间的潜在机制联系提供了新见解，并支持miR-874-ZNF217-MTBP-MDM2-p53轴可能有助于CCOC发病机制的假设。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究：从GEO数据库获取GSE46735、GSE94533、GSE230956、GSE239685和GSE214239等多个数据集，涵盖血浆样本、血清样本和组织样本；使用双向双样本孟德尔随机化(MR)分析评估EMS与CCOC的因果关系；通过limma包进行差异基因表达分析；利用KMplot工具进行生存分析；采用加权基因共表达网络分析(WGCNA)识别共表达模块；使用miWalk数据库预测miRNA靶基因；应用EcoTyper算法分析肿瘤微环境组成；整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据和ChIP-Seq数据探索基因表达调控机制。

3.1 双向双样本孟德尔随机化分析确认EMS是CCOC发展的因果因素

研究人员使用EBI GWAS数据库中的EMS数据集(ebi-a-GCST90018839)作为暴露因素，IEU数据库中的CCOC数据集(ieu-a-1124, n=42,307)作为结果，进行了双向双样本MR分析。使用逆方差加权(Inverse Variance Weighting, IVW)方法评估了EMS对CCOC发展的因果效应。留一法敏感性分析表明，去除任何单个SNP都不会显著改变因果效应估计，说明没有单个SNP不成比例地影响整体效应。组合效应显著，单个SNP的效应方向基本一致，支持了因果关联的可信度。漏斗图分析表明MR结果没有偏差，显示了研究结果的稳健性。结果表明EMS是CCOC发展的潜在因果因素，而反向关系未得到支持。EMS的发生可能参与CCOC的发展，但未观察到EMS与EOC之间存在显著因果关联。

3.2 血浆miR-874在EMS中的下调与CCOC相关

研究人员使用多个独立数据集分析了miRNA表达变化及其潜在临床意义。在EMS患者的血浆miRNA数据集(GSE46735)中，鉴定出几个差异miRNA。通过交叉不同阶段的数据，发现10个miRNA在各个阶段显示差异表达。研究发现miR-874在子宫内膜异位症和与子宫内膜异位症相关的CCOC中持续下调。为了评估这些miRNA的潜在临床相关性，使用KMplot进行了生存分析。发现四个miRNA(miR-148a、miR-155、miR-502和miR-874)在三种常见妇科癌症(包括宫颈鳞状细胞癌、卵巢癌和子宫内膜癌)中具有一致的预后作用。值得注意的是，这些miRNA的较高表达水平与较长患者生存期相关，表明具有保护作用。

研究人员进一步使用包含180例不同组织病理学亚型卵巢癌病例的血清miRNA转录组数据的数据集GSE94533验证了这些发现。在四个miRNA中，只有miR-874持续差异表达，在EMS患者中显示显著下调。在数据集GSE239685(n=20)中，确认了CCOC患者血清miR-874与健康供体相比下调。在数据集GSE214239(n=8)中，发现组织渗出性细胞外囊泡(Tissue-exudative Extracellular Vesicles, Te-EVs)中的miR-874在CCOC中低于正常卵巢。此外，对伴有EMS的CCOC患者的转录组分析(GSE230956)也显示miR-874下调。因此，miR-874在多个数据集中的持续下调表明，其在EMS患者中的表达减少可能与CCOC及其他妇科恶性肿瘤的发展相关。

3.3 miR-874在CCOC中分子机制的探索

为了研究miR-874的潜在机制，研究人员使用TCGA卵巢癌数据集进行了差异基因表达分析。根据miR-874水平将样本分为高表达组和低表达组，低表达组作为对照。共鉴定出194个差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)，其中ASB9、TMSB10P1、SMIM24和PDLIM4是最显著上调的基因。在PubMed数据库中的文献检索发现，ASB9作为细胞生长的负调节因子，这与先前认为miR-874可能作为肿瘤抑制因子的发现一致。GO功能分析显示这些DEGs与线粒体基质、细胞粘附、蛋白酶体蛋白降解和GTPase活性调节相关。通路分析显示，下调基因在p53信号通路中富集，包括MTBP、RAD18、ZNF217和NDRG1。

考虑到miRNAs通常通过负调节靶基因表达发挥作用，研究人员进行了生存分析以评估这些DEGs的预后相关性。分析表明，大多数下调基因与卵巢癌患者的生存结果显著相关。具体而言，ZNF623、NDRG1、ZNF7、MTBP和PHF20L1在高miR-874表达的组织中下调，这些基因的较低表达与改善的生存相关。相反，在上调基因中，ASB9与较好的生存结果相关，而PDLIM4和ECRG4的高表达与较差的预后相关。使用GSE230956数据集的进一步验证证实，在高miR-874表达的TCGA组织中鉴定出的一些下调基因在伴有EMS的CCOC患者中上调，表明这些基因可能有助于CCOC的发病机制。

3.4 肿瘤微环境与miR-874表达相关

EcoTyper是一种用于分析转录组数据的先进工具，特别适用于解卷积复杂组织(包括肿瘤)的细胞组成和细胞状态。使用基于机器学习的方法，EcoTyper从基因表达数据中识别不同的细胞亚型及其丰度。考虑到肿瘤由多样的细胞群组成，研究人员应用EcoTyper定量分析卵巢癌组织中的细胞类型丰度，从而能够更深入地了解与miR-874表达相关的肿瘤微环境。

此分析揭示了三种与高miR-874表达相关的细胞亚型。具体而言，Endothelial.cells.5(肌上皮样细胞)和Fibroblasts.1(肌成纤维细胞样细胞)在高miR-874表达的组织中上调，而Fibroblasts.8(迁移样细胞)下调。在这些细胞类型中，较高的fibroblasts.1丰度与较长的生存期相关。这些发现表明，高miR-874表达与更有利的肿瘤表型相关，这与在miR-874水平升高的患者中观察到的改善预后一致。

3.5 MiR-874可能通过靶向ZNF217抑制肿瘤发生

为了进一步研究miR-874功能的分子机制，研究人员对先前分析中鉴定的DEGs进行了WGCNA。此分析提示miR-874与NDRG1以及ZNF217之间存在潜在的调控关系。为了验证这些发现，使用miWalk进行了靶基因预测，在下调基因中鉴定出NDRG1和ZNF217作为miR-874的潜在直接靶标。从机制上讲，miR-874可能通过互补结合NDRG1的3'UTR和ZNF217的CDS区域发挥其作用。这些发现表明，miR-874可能通过调节卵巢癌中的关键癌基因发挥肿瘤抑制作用。

3.6 NDRG1和ZNF217在子宫内膜异位症相关卵巢癌中上调

单细胞分析显示，NDRG1主要在卵巢基质细胞中表达，而ZNF217主要在卵巢基质细胞、平滑肌细胞和免疫细胞中表达。为了进一步研究这些基因的功能相关性，研究人员分析了ME2共表达模块，该模块使用Reactome数据库确定与p53信号通路显著相关。文献证据强调了该模块中几个与p53调节直接相关的基因，包括NDRG1、MTBP、PVT1、RAD18和ZNF217。蛋白质表达分析进一步证实，NDRG1和ZNF217在EMS相关卵巢癌中上调。值得注意的是，ZNF217作为一种在肿瘤发生中具有明确作用的转录因子，与患者生存显著相关。鉴于其在p53信号通路中的直接调节作用，研究人员假设ZNF217可能受miR-874调节。

为了探索这一调控网络，进行了ChIP-Seq(染色质免疫沉淀测序)数据分析，显示ZNF217结合到MTBP的上游启动子区域。由于miR-874在EMS血液中下调，研究人员提出一个假设：卵巢组织miR-874水平的降低导致转录因子ZNF217的上调。这进一步激活了MTBP的转录，从而稳定了p53负调节因子MDM2，导致p53信号通路活性降低，诱导卵巢上皮细胞的上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)，并促进CCOC的发展。基于这些发现，研究人员提出了一个miR-874-ZNF217-MTBP-MDM2-p53调控轴，该轴可能在EMS向CCOC的发展中起关键作用。

讨论与结论

本研究通过整合生物信息学、基因组学和转录组学技术，对EMS向卵巢癌转化的潜在机制进行了多维度系统分析。使用MR分析确认了EMS是CCOD发展的关键 predisposing 因素。多个数据集的生物信息学分析进一步揭示，miR-874的下调与EMS发生、卵巢癌进展和患者生存密切相关。在低miR-874表达的肿瘤组织中，观察到ZNF217、MTBP、NDRG1、RAD18和PVT1的显著改变，这些基因均与p53信号通路相关。研究人员还探索了miR-874下调如何诱导ZNF217上调，这与MTBP过表达相关并增加MDM2稳定性，最终抑制p53信号活性并促进肿瘤进展。临床样本证实了与miR-874相关的分子ZNF217和NDRG1的异常。这些发现为改善EMS和CCOC预后及开发个性化治疗策略提供了科学依据和新见解。

尽管进行了全面的多组学分析和整合大型公共数据集，本研究仍有几个局限性。首先，一些数据集包含的样本量相对较小，可能引入抽样偏差并限制研究结果的普适性。降低的统计效能也可能增加差异基因表达分析中假阳性或假阴性的风险。其次，虽然使用多个独立数据集交叉验证了miR-874在EMS和CCOC中的表达模式，但调控机制和下游效应主要通过生物信息学方法推断，缺乏体内或体外实验验证。第三，提出的miR-874-ZNF217-MTBP-MDM2-p53轴需要进一步的实验确认以建立因果关系。值得注意的是，本分析中使用的差异表达基因(DEGs)来源于TCGA卵巢癌队列，因此研究结果更广泛地代表卵巢癌而不是特定于CCOC，这有待在未来的研究中通过实验验证。

未来的工作应包括在CCOC细胞系中进行miRNA操作、临床样本中的表达分析、靶标验证实验以及免疫组织化学或多重免疫荧光来验证关键细胞亚型等实验方法。这些步骤将有助于证实计算分析预测的分子机制。

总体而言，这项研究揭示了miR-874在EMS相关CCOC中的关键调控作用，提出了一个新的分子调控轴，为理解EMS恶性转化的分子机制提供了重要线索，也为开发新的诊断标志物和治疗策略奠定了理论基础。这些发现不仅增进了对EMS相关CCOC复杂分子机制的理解，还突出了miR-874作为改善CCOC患者预后的潜在生物标志物和治疗靶点。