免疫异质性关键预后蛋白ZC3H12D在口腔鳞癌中的作用机制及预后模型与耐药性分析

　　本研究针对口腔鳞癌(OSCC)缺乏特异性早期诊断标志物及免疫治疗响应率低的问题，通过生物信息学分析鉴定出关键免疫相关基因ZC3H12D。研究构建了包含临床和分子变量的列线图模型，可准确预测患者1、3、5年生存率（AUC=0.756）。发现ZC3H12D高表达与更好预后相关，并通过GO/KEGG/GSEA分析揭示其参与免疫调节通路。免疫浸润分析显示ZC3H12D与多种免疫细胞浸润显著相关，为OSCC免疫治疗提供新靶点。

　　

口腔鳞状细胞癌(OSCC)作为最常见的口腔恶性肿瘤，占所有口腔肿瘤病例的90%，其治疗面临巨大挑战。尽管现有治疗手段包括辅助放疗、靶向治疗和生物治疗等多种方式，但由于缺乏高特异性早期诊断标志物，晚期患者治疗效果和预后仍不理想。更令人困扰的是，近年来兴起的免疫治疗虽然为口腔癌治疗提供了新途径，但存在响应率不高、免疫相关不良事件以及肿瘤异质性导致的个体差异等问题。这些困境使得探索OSCC的分子标志物和免疫机制成为当务之急。

在此背景下，研究人员在《Discover Oncology》发表了这项创新性研究，旨在通过先进的生物信息学方法揭示OSCC免疫异质性的关键基因，并构建精准的预后预测模型。

研究采用多组学数据分析策略，主要技术方法包括：从TCGA数据库获取314例OSCC样本和44例癌旁组织的mRNA测序数据，补充GEO数据库GSE30784数据集（包含167例OSCC、17例异型增生和45例正常口腔组织）；使用CIBERSORT算法计算22种免疫细胞浸润比例；通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选免疫相关差异基因；采用DESeq2进行差异表达分析；运用LASSO、随机森林和XGBoost三种机器学习算法构建预后模型；进行GO、KEGG功能富集分析和基因集富集分析(GSEA)；使用ssGSEA方法评估肿瘤微环境组成。

3.1 数据流程

研究整合了TCGA数据库中头颈鳞癌(HNSC)的TPM数据集，经过临床数据筛选后获得314例OSCC样本和44例癌旁组织的高质量mRNA测序数据。同时从GEO数据库下载GSE30784数据集进行对比分析，该数据集包含167例OSCC、17例异型增生和45例正常口腔组织的基因表达数据。

3.2 OSCC免疫相关差异基因筛选

通过CIBERSORT分析获得22种免疫细胞比例，差异分析发现OSCC组织与正常组织在10种免疫细胞类型上存在显著差异：初始B细胞、记忆B细胞、初始CD4⁺T细胞、静息记忆CD4⁺T细胞、滤泡辅助T细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、静息树突细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞。WGCNA分析以软阈值7构建共表达网络，通过动态树切割确定不同模块，最终生成12个模块。其中turquoise模块与差异免疫细胞相关性最高，根据MM>0.5、GS>0.3和p<0.05的标准筛选关键模块基因，并提取记忆B细胞、M0巨噬细胞和活化肥大细胞的关键模块基因交集作为差异免疫细胞相关基因。

3.3 免疫相关基因预后模型构建

基于OSCC差异基因与WGCNA免疫细胞相关共表达基因的交集，筛选出135个关键免疫相关基因。通过COX回归模型进行初步预后相关性筛选，随后使用LASSO、随机森林和XGBoost三种机器学习算法进一步细化特征基因集。LASSO回归绘制了λ选择图和10折交叉验证图，随机森林生成了变量重要性投影(VIP)图，XGBoost绘制了COX风险比例回归负偏倚对数随迭代次数变化图。最终通过三种机器学习方法固化了由6个基因组成的OSCC预后模型。

3.4 ZC3H12D基因被确定为OSCC的关键预后基因

对6个交叉基因进行多因素COX回归分析，以ZC3H12D基因的p值最小而被确定为关键基因。表达差异分析显示ZC3H12D基因在口腔癌组织中表达显著升高。pan-cancer分析表明ZC3H12D在多种癌症类型中均呈现高表达特征。ROC曲线显示ZC3H12D分子的曲线下面积(AUC)为0.756。根据ZC3H12D中位表达水平将患者分为两组，生存分析显示低表达组患者的总生存期(OS)和疾病特异性生存期(DSS)显著优于高表达组，提示ZC3H12D可能作为抑癌基因发挥作用。进一步分析发现，低ZC3H12D表达与不同病理T分期和初始治疗结果组中较差的生存结局显著相关。

3.5 ZC3H12D生物学和通路分析

对ZC3H12D基因进行全面的Spearman相关分析，通过弦图展示与其最显著相关的10个基因间的复杂相互作用。根据ZC3H12D表达水平将患者数据分为高表达和低表达组，应用logFC>1.5和p<0.05标准筛选出439个显著差异基因。通过GO和KEGG富集分析揭示这些差异表达基因在生物过程和代谢通路中的具体作用。GSEA分析进一步验证这些基因在特定生物过程中的富集情况。

3.6 ZC3H12D影响肿瘤免疫微环境

使用CIBERSORT、ssGSEA和ESTIMATE三种免疫浸润分析方法深入研究ZC3H12D在免疫细胞浸润中的表现。CIBERSORT分析显示ZC3H12D与多种免疫细胞类型显著相关，且高、低表达组间这些免疫细胞比例存在显著差异。ssGSEA分析进一步验证了ZC3H12D与多种免疫细胞类型的相关性，并显示不同免疫细胞类型在高、低表达组间的富集分数存在明显差异。比较ZC3H12D高、低表达组间的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分，发现高表达组的免疫评分和ESTIMATE评分显著高于低表达组。进一步分析显示ZC3H12D表达水平与免疫评分和基质评分均呈显著正相关。

研究结论与讨论部分强调，该研究不仅构建了实用的OSCC预后评估列线图模型，还深入揭示了ZC3H12D基因在口腔癌发生发展中的重要作用。ZC3H12D被确定为一种新型的TLR信号和巨噬细胞激活的负调控因子，可能作为抑癌基因发挥作用。该基因通过JNK和NF-κB通路被TLR配体诱导，过表达可抑制TLR2和TLR4激活，进而抑制JNK、ERK和NF-κB信号，减少巨噬细胞的炎症反应。这些发现为理解OSCC免疫微环境调节机制提供了重要见解，并为开发针对ZC3H12D的免疫治疗策略提供了理论和数据支持。

研究的局限性包括样本量可能限制结果的普适性，单中心研究可能引入偏倚影响外部有效性，ZC3H12D与其他基因和通路的潜在相互作用机制需要进一步阐明，以及预测模型需要在独立队列中验证其稳健性和临床适用性。

最终结论表明，ZC3H12D在OSCC肿瘤微环境中发挥重要作用，高表达ZC3H12D的患者预后更好，而高分期的OSCC患者ZC3H12D表达水平较低。这些发现提示ZC3H12D通过促进T细胞相关细胞免疫在OSCC肿瘤微环境中发挥抑癌作用，为改善OSCC治疗效果特别是提高免疫治疗响应率提供了新思路和策略。