整合单细胞转录组学与孟德尔随机化揭示中性粒细胞相关基因PRDX1和FTH1在结直肠癌中的关键作用及免疫治疗新靶点

　　本研究针对结直肠癌(CRC)中中性粒细胞浸润机制不清的问题，通过整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)、孟德尔随机化(MR)和共定位分析，发现PRDX1和FTH1是中性粒细胞相关关键因果基因，与免疫细胞浸润显著相关并参与活性氧(ROS)等通路，为CRC免疫治疗提供新靶点。

　　

结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，给社会经济和公共卫生带来沉重负担。尽管手术、化疗、放疗和靶向治疗等传统手段不断进步，但治疗毒副作用和高达54%的复发率仍是严峻挑战。近年来，免疫治疗为CRC患者带来了新希望，但肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)的复杂性仍是制约疗效的关键因素。

中性粒细胞作为循环白细胞中占比最高的免疫细胞(50%-70%)，在肿瘤免疫调控中扮演着双刃剑角色。它们可分化为抗肿瘤的N1表型和促肿瘤的N2表型，通过分泌细胞因子、活性氧(ROS)和酶类物质，直接或间接影响肿瘤进展。然而，中性粒细胞在CRC中的具体作用机制仍不明确。单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术的出现，为在单细胞水平解析免疫细胞异质性和功能状态提供了强大工具，而孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)方法则能通过遗传变异推断基因表达与疾病风险的因果关系，两者结合为探索CRC中性粒细胞相关机制提供了新思路。

在这项发表于《Discover Oncology》的研究中，Yan等研究人员整合scRNA-seq、MR和共定位分析，旨在揭示中性粒细胞相关基因在CRC中的因果作用机制，为开发新的免疫治疗策略提供靶点。

研究人员主要采用了几项关键技术方法：从GEO数据库获取scRNA-seq数据(GSE231559)并进行质量控制；使用Seurat包进行细胞降维聚类和注释；从eQTLGen联盟获取表达数量性状位点(eQTL)数据；利用日本生物银行(BioBank Japan, BBJ)队列(bbj-a-107)进行两样本MR分析；通过共定位分析鉴定关键因果基因；采用CIBERSORT进行免疫浸润分析；使用Monocle进行伪时间分析；并通过人类蛋白质图谱(HPA)数据库进行免疫组化验证。

3.1 单细胞数据质量控制、降维聚类和细胞注释

通过对9个样本的scRNA-seq数据分析，研究团队在质控后保留了38,719个细胞，通过UMAP可视化识别出16个转录簇，最终注释为9种主要细胞类型：上皮细胞、T细胞、单核细胞、B细胞、成纤维细胞、NK细胞、肥大细胞、中性粒细胞和内皮细胞。

3.2 细胞通讯和差异分析

使用CellCall工具分析细胞间通讯，发现不同细胞类型间存在复杂的相互作用网络。通过FindAllMarkers功能筛选出628个中性粒细胞差异表达基因(DEGs)，用于后续分析。

3.3 孟德尔随机化

MR分析揭示了8个与CRC风险显著相关的基因：FTH1、LCP1、PRDX1、SCP2、HLA-F、XBP1、HLA-C和TXN。其中HLA-C、LCP1、PRDX1、SCP2和XBP1与疾病低风险相关，而FTH1、HLA-F和TXN与高风险相关。共定位分析进一步确定PRDX1和FTH1为关键因果基因。

3.4 免疫浸润和药物敏感性

免疫浸润分析显示，与对照组相比，疾病组的巨噬细胞M0、巨噬细胞M1和活化肥大细胞水平显著升高，而初始B细胞、巨噬细胞M2、静息肥大细胞、活化NK细胞、浆细胞和CD8⁺ T细胞显著减少。FTH1和PRDX1与多种免疫细胞类型呈现显著相关性，表明这些关键基因与免疫微环境密切相关。药物敏感性分析发现这两个基因与多种化疗药物敏感性相关。

3.5 关键基因相关信号通路和转录因子调控网络

GSEA分析显示，FTH1显著富集于同种异体移植排斥、IgA产生的肠道免疫网络和1型糖尿病等通路；PRDX1则富集于PI3K-Akt信号通路、造血细胞谱系以及Th1和Th2细胞分化等通路。GSVA分析表明这两个基因均与活性氧通路和氧化磷酸化等过程密切相关。

3.6 关键基因表达丰度和伪时间分析

单细胞水平表达可视化显示FTH1在所有细胞中广泛表达，而PRDX1表达更为局限。伪时间分析显示单核细胞主要分布在细胞分化的早中期，而中性粒细胞主要分布在分化后期。FTH1表达随细胞分化先升高后下降，PRDX1表达则先下降后升高趋于稳定。

3.7 免疫代谢通路

AUCell分析显示，PRDX1在myc_targets_v1、氧化磷酸化和活性氧通路中活性较高；FTH1在活性氧通路和氧化磷酸化中活性较高。

3.8 免疫组化验证

从HPA数据库获取的免疫组化染色结果显示，PRDX1在CRC组织和正常组织中蛋白表达相同，而FTH1在CRC组织中的蛋白表达低于正常组织。

研究结论与讨论部分指出，CRC仍然是一个全球性的重大公共卫生问题，尽管治疗手段不断进步，但晚期病例的患病率仍在持续上升，肿瘤一旦产生耐药性，其复发和转移速度会显著加快，这使得扩展CRC治疗策略变得尤为紧迫。

中性粒细胞通过不同功能模式调节先天和适应性免疫系统，在肿瘤相关的炎症反应中扮演关键角色。在肿瘤发生早期，中性粒细胞通常表现出抗肿瘤活性，但随着肿瘤进展，中性粒细胞行为转变为支持肿瘤生长，促进慢性炎症和转移机制。

本研究通过单细胞测序技术结合先进生物信息学方法，仔细分析了CRC中存在的各种细胞异质性，揭示了细胞簇和亚型，极大增强了我们对CRC细胞群落组成和功能差异的理解。在628个中性粒细胞DEGs中，应用MR分析识别出8个与CRC有因果关系的基因，并通过eQTL和共定位分析以及反向MR验证分析确定了结果的稳健性，最终认定两个基因为核心关键基因：PRDX1是与CRC低风险相关的基因，而FTH1与这种特定恶性肿瘤的高风险相关。

进一步研究发现这两个关键基因与免疫因素之间存在密切关系，观察到免疫标志物在样本间的差异分布以及免疫因素间的显著相互关联。值得注意的是，这两个基因都表现出与免疫细胞浸润模式和肿瘤微环境特征的强烈关联。FTH1和PRDX1通过不同的免疫调节网络在塑造抗肿瘤免疫力方面扮演关键但 distinct的角色：FTH1可能通过正向调节CD8⁺ T细胞、Tregs和中性粒细胞来增强抗肿瘤免疫反应，同时抑制初始B细胞、CD4⁺ T细胞和树突状细胞活性，表明其具有免疫激活和免疫抑制的双重作用；而PRDX1显著促进CD8⁺ T细胞、记忆性活化CD4⁺ T细胞、滤泡辅助T细胞、M1型巨噬细胞和静息树突状细胞的浸润，但抑制初始B细胞、静息记忆CD4⁺ T细胞、Tregs、静息肥大细胞和活化肥大细胞的功能，表明其倾向于塑造促炎性免疫微环境。这两个基因的协同或拮抗效应可能通过调节氧化应激通路(如铁代谢/FTH1)和抗氧化防御(PRDX1)的动态平衡，最终调节肿瘤免疫监视或免疫逃逸过程，进而影响免疫细胞的极化状态和功能表型。

此外，计算预测表明这些基因与化疗药物(包括顺铂和多西他赛)敏感性存在显著相关性。这些发现为理解CRC中中性粒细胞免疫的功能机制提供了新思路，有助于发现新的治疗靶点。尽管这项研究通过单细胞和MR分析为CRC中的中性粒细胞相关基因提供了宝贵见解，但仍存在一些局限性，需要在未来通过多层次证据的研究来验证这些发现。