高通量全基因组测序新策略：优化甲型流感病毒多宿主监测与基因组缺失检测

　　为解决甲型流感病毒(IAV)全基因组测序中聚合酶基因段覆盖率低和测序通量受限的问题，研究人员优化了多片段RT-PCR(mRT-PCR)反应条件并开发了双重条形码策略。该研究显著提升了低病毒载量样本的基因组覆盖均一性，支持8重样本混合测序而不损失灵敏度，为跨宿主传播监测和缺陷病毒基因组(DVG)鉴定提供了有力工具。

　　

甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)是一种具有分段基因组的RNA病毒，其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的多样性导致多种亚型存在。野生水禽是IAV的天然宿主，但病毒可传播至家禽、猪和人类，引发人兽共患疾病甚至大规模流行。病毒通过其易错聚合酶产生的点突变或重配事件驱动进化，这可能影响病毒适应性、抗病毒耐药性及跨物种传播能力。因此，对IAV进行全基因组测序(Whole-Genome Sequencing, WGS)对于监测病毒演变、发现新变种、评估疫苗和药物效果至关重要。

尽管基于保守末端引物的多片段RT-PCR(mRT-PCR)技术已被广泛用于IAV全基因组测序，但在处理低病毒载量样本时，尤其是对最大的聚合酶基因段(PB2、PB1、PA)的回收仍存在挑战。第三代测序技术如牛津纳米孔测序(Oxford Nanopore sequencing)虽具便携和实时优势，但通量较低，限制了大规模监测的应用。

为解决这些问题，Licheri等研究人员在《Genome Medicine》上发表了其最新研究成果。他们对现有mRT-PCR方法进行了系统性优化，调整了逆转录(RT)与PCR反应条件，并引入双重条形码策略，显著提高了测序通量和灵敏度，建立了一个适用于禽类、猪和人类来源IAV样本的高通量全基因组测序流程。

研究采用的主要关键技术方法包括：使用LunaScript RT Master Mix和Q5高保真DNA聚合酶进行优化后的两步骤mRT-PCR；设计24对定制PCR条形码引物实现样本多重化；基于纳米孔测序平台（MinION或GridION）进行测序；使用IRMA软件进行全基因组组装和变异检测；利用自临床样本（包括人鼻拭子、禽类和猪口腔/鼻拭子）的病毒RNA进行验证。

研究结果

A modified two-step approach increases IAV whole-genome recovery and representation

通过比较Zhou等（2009和2012）和Rambo-Martin等（2020）的现有方法，研究人员发现优化后的RT（55°C）和PCR（64°C退火）条件显著改善了所有八个基因段的扩增平衡性。即使在低病毒载量（Cp值达35）条件下，新方法仍能清晰检测到所有目标条带，测序读长中病毒序列比例提高，非特异性扩增减少。通过读长归一化分析，新方法在各稀释梯度均实现均匀的基因段覆盖，尤其改善了大型聚合酶基因段的回收效率。

Scalable dual-barcoding approach enables high-throughput whole-genome sequencing of IAV

研究人员设计了24对与纳米孔测序兼容的PCR条形码引物，每对包含独特分子标识。测试表明，使用这些引物进行扩增后，混合8个样本进行单次纳米孔文库制备仍能恢复全部基因段，且测序深度均超过50×。双重条形码策略使得每个纳米孔原生条形码可容纳8个样本，大幅提升测序通量，而灵敏度未受明显影响。

High-throughput whole-genome sequencing of IAV from diverse clinical samples

应用单重和双重条形码策略对24例临床样本（包括人、猪和禽类来源，亚型涵盖H1N1、H3N2、H5N1等）进行测序验证。优化后的流程在21例样本中成功获得病毒序列，其中18例完成全基因组重建。低病毒载量样本（如Cp值高于27.7）仍可检测，但基因组覆盖度有所下降。此外，研究在部分样本中鉴定出缺陷病毒基因组(DVG)，主要存在于PB1、PB2和PA大片段中，显示该方法在病毒基因组完整性研究中的应用潜力。

结论与讨论

本研究通过优化反应条件和引入双重条形码策略，成功提升了IAV全基因组测序的灵敏度、通量和应用范围。新流程在低病毒载量下仍能保持高病毒读长比例和均匀覆盖，支持对禽类、猪及人类来源样本的高效测序。双重条形码策略可实现每纳米孔条形码混合8样本，为大规模监测提供经济、高效的解决方案。此外，该方法的DVG检测能力为研究病毒复制机制和宿主应答提供了新工具。这一优化流程将加强IAV在人与动物界面的基因组监测，有助于早期发现传播事件、跟踪病毒进化及指导防控策略。