甲氨蝶呤脂质体实现猪模型眼内6周持续药物释放：突破性缓释制剂的开发与评价

　　本文推荐了一种创新的甲氨蝶呤（MTX）脂质体缓释制剂，该制剂可通过30G针头单次玻璃体内注射，在大型动物（猪）模型中实现超过6周的治疗水平药物释放（0.1–2 μg mL?1）。相比传统频繁注射和需手术植入的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）植入物（如Ozurdex），该磷脂基脂质体系统具有优异生物相容性，并经光学相干断层扫描（OCT）和视网膜电图（ERG）验证，为眼内淋巴瘤和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）的临床治疗提供了优化方案。

　　

引言

玻璃体内给药已彻底改变视网膜疾病的治疗格局。通过直接作用于视网膜，该给药方式可最大限度地减少全身副作用。然而，蛋白质、肽和小分子药物的半衰期及其所需的注射频率差异巨大。对于小分子药物，其半衰期通常极短，因此需要频繁给药。甲氨蝶呤（MTX）正是一种小分子叶酸抗代谢物，已被证明可有效治疗眼内淋巴瘤，最近也成为治疗增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）的首个有效药物干预手段。

尽管结果前景广阔，但由于甲氨蝶呤的玻璃体内半衰期极短（约7.6小时），其并未得到广泛的临床应用。单次注射400 μg MTX后，其治疗水平（0.1–2 μg mL^?1）仅能维持72小时，这通常需要每两周注射一次的方案。此外，注射后产生的高浓度MTX峰（高达600 μg mL^?1或1321 μm）可能产生细胞毒性效应，并导致眼内炎和角膜上皮病变等并发症。这些缺点，加上给患者生活带来的巨大财务、心理和社会负担，阻碍了MTX在其他适应症中的广泛使用。

这些主要局限性可以通过持续给药系统来克服。一种方法是使用基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）的固体植入物，但此类系统此前仅在体外进行过评估。虽然这种方法可以消除治疗负担和高浓度峰值等问题，但由于植入物的尺寸，需要昂贵的制造工艺和特定的相对较大孔径（22G）注射器。这在眼内淋巴瘤等病例中尤其令人担忧，因为存在较高的肿瘤种植风险。

在纳米凝胶、树枝状聚合物和聚乳酸纳米颗粒等其他纳米载体中，磷脂基脂质体制剂为小分子创造了第二道扩散屏障，为缓释玻璃体内给药提供了一种有前景的替代方案。脂质体的小尺寸（100–150 nm）及其结构不会损害视觉功能，同时能够实现可控的药物释放，显著延长药物在玻璃体内的半衰期，并且在某些情况下还能提高生物相容性。此外，脂质体制剂可使用细孔径的30G针头进行注射，不需要复杂的注射器系统，并且与固体植入物相比，可以通过调整注射体积轻松滴定不同适应症的剂量，是一种成本效益高的替代方案。

脂质体MTX和PLGA固体植入物这两种方法从未在体内进行过比较。更具体地说，与脂质体制剂在角膜上的局部使用不同，当前标准（极低多分散指数和100–120 nm直径）的玻璃体内注射脂质体制剂的眼内药代动力学从未在大型动物模型中进行研究。此外，这些制剂的生物相容性评估也从未在转化性大型动物模型中进行。因此，本研究的主要目的是在体内评估脂质体药代动力学，并将其与PLGA植入物等更具侵入性的给药方法进行直接比较。

结果

脂质体的表征

采用动态光散射对含有平衡盐溶液（BSS）或溶解在BSS中的MTX的脂质体制剂进行了尺寸、多分散指数（PDI）和Zeta电位的表征。仅含BSS的脂质体的平均尺寸为115.6 nm（SD = ± 0.43），PDI为0.242（SD ± 0.034），Zeta电位为-10.75 mV。用MTX溶液获得的脂质体平均尺寸为119.5 nm（SD = ± 0.45），PDI为0.197（SD = ± 0.009），Zeta电位为-10.66 mV。通过反相高效液相色谱法（HPLC）测定，实现了57.13%的高包封效率和约14.44%的药物负载。MTX负载制剂的冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）图像显示脂质体具有低层数（主要是单层）结构。

体外细胞毒性评估

在0.005至1.25 mg mL^?1的浓度范围内，空载脂质体制剂的添加并未损害人视网膜色素上皮（RPE）细胞（ARPE-19）的活力。

PLGA植入物的降解表征

在猪模型评估之前，首先在体外后段灌注模型中研究了PLGA植入物的降解情况。记录了在灌注模型中放置21天前后的冷冻扫描电子显微镜（cryo-SEM）图像。此外，为了展示植入物中MTX的均匀分布，将植入物分为5部分，并评估了每部分的MTX含量。观察到非常均匀的MTX分布。

MTX负载脂质体和PLGA制剂的体外和体内甲氨蝶呤释放

用于体内猪实验的动物被分为四组。一只注射了400 μg游离MTX的动物显示出预期的指数衰减，在5天内降至治疗浓度以下。在四只猪中玻璃体内注射0.075 mL含400 μg MTX的脂质体后，对药物释放进行了为期6周的监测。释放曲线显示，房水中的甲氨蝶呤浓度逐渐上升，在14天时达到峰值C_max为6.6 ± 1.3 μg mL^?1。随后，MTX浓度在整个6周的观察期内保持在1 μg mL^?1的治疗浓度以上。在研究结束时（第42天），平均浓度为7.5 ± 1.2 μg mL^?1。这些结果表明，单次玻璃体内注射MTX负载脂质体制剂可以在大小与人眼相似的眼中提供持续的药物释放，并在延长时间内维持治疗相关的MTX浓度。

作为比较，PLGA基棒材在猪眼中的体内释放也证明了MTX持续释放超过42天。两只猪在第1天的初始MTX浓度约为4–5 μg mL^?1。在第2天到第14天之间观察到一个稳定的释放阶段，两只动物的浓度范围约为4.5至6 μg mL^?1，直至第42天。在整个研究过程中，MTX水平保持在1–2 μg mL^?1的治疗阈值以上。对MTX脂质体和PLGA植入物进行了直接比较。

在模拟房水流速为2.5 μL min^?1的后段模型中研究相同的PLGA植入物时，达到了平均0.3 ± 0.1 μg mL^?1（SEM）的稳态MTX浓度。

玻璃体内给药的MTX负载和控制脂质体制剂的生物相容性评估

在六只动物（每组n = 3）中评估了空载和MTX负载脂质体的生物相容性，为期6周。眼底镜检查显示视网膜和血管外观正常，无眼内炎症迹象。光学相干断层扫描（OCT）成像显示视网膜层保留，无视网膜水肿、萎缩、脱离或其他结构异常的证据。平均中央视网膜厚度在治疗前后保持可比。眼内压（IOP）在所有时间点均保持在正常范围内。接受平衡盐溶液（BSS）假注射的动物显示出相似的生物相容性结果。注射脂质体制剂的6只眼的视网膜电图（ERG）显示，与对侧对照眼相比，6周时a波和b波的振幅或潜伏期没有显著的个体内差异。组织学分析显示，注射空载脂质体制剂或MTX负载脂质体的眼睛，其视网膜结构在苏木精和伊红（H&E）染色中均无破坏。对注射MTX脂质体的眼睛进行免疫染色显示，与未处理的左对照眼相比，白细胞浸润没有增加，神经胶质增殖没有增加，小胶质细胞活化也没有增加。

讨论

本研究提出了一种使用脂质体的新策略，该脂质体针对甲氨蝶呤的玻璃体内应用进行了优化。该制剂在猪模型中表现出高生物相容性和持续释放的药代动力学特性，持续时间超过6周，与玻璃体内给药的游离MTX相比，持续时间显著增加。此外，将该脂质体制剂与需要通过较大切口手术植入的固体PLGA植入物进行了比较，并证明其在药代动力学上相似，但可通过标准的30G针头注射。此外，所呈现制剂的所有成分都很容易以药品生产质量管理规范（GMP）质量获得。

此前，针对多种药物已经研究了用于玻璃体内给药的脂质体制剂。虽然也显示出可提高大分子尺寸抗体疗法的眼内水平，但最大的效果体现在通常从玻璃体腔快速清除的小分子药物上。这些研究主要集中于治疗感染的药物，脂质体制剂在各种动物模型中针对抗生素、抗病毒和抗真菌药物进行了开发和测试。迄今为止，尚无研究检测玻璃体内应用的MTX负载脂质体的药代动力学。

由于使用长白猪及其快速生长曲线，玻璃体内注射后的随访时间限制在6周。然而，长白猪的眼部解剖结构与人类眼睛非常相似，包括一个富含视锥细胞的中央视网膜区域（类似于人类的黄斑）和小梁网流出系统。此外，6周的随访是PVR发展的临床相关术后时间段，也是一个可行的再治疗间隔。在本研究中，我们成功评估了药代动力学，因此，在进一步的研究中，仍需证明其在PVR或玻璃体内淋巴瘤中的疗效。

结论

总之，我们提出了一种使用脂质体制剂的新策略，用于抗增殖剂甲氨蝶呤的持续玻璃体内释放，持续时间超过6周。虽然未进行药效学评估，但其良好的药代动力学特性、低个体间变异性以及通过体内测试确定的高生物相容性，将支持在未来临床试验中进行临床研究。

实验部分

脂质体采用薄膜法和双离心法制备。使用卵磷脂和胆固醇用于脂质体配方。通过动态光散射测定脂质体的平均粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位。通过反相HPLC测定MTX的包封效率。通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）观察脂质体结构。

PLGA植入物按照所述方法制备。通过扫描电子显微镜（SEM）对植入物进行成像。使用注射泵以恒定的BSS流速进行体外释放实验。

使用十六只初始体重为30至40公斤的长白猪进行本研究。实验遵守ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明，并获得了当地伦理委员会的批准。所有程序均在无菌条件下使用手术显微镜在右眼进行。猪被用于药代动力学或生物相容性研究。

药代动力学组重点分析了400 μg游离MTX、400 μg脂质体包裹的MTX或负载400 μg MTX的PLGA植入物的药物释放动力学。在玻璃体内注射（IVI）后24、48、72小时以及1、2、4和6周进行房水穿刺，使用高效液相色谱法（HPLC）测定药物浓度。

生物相容性组接受含有空载脂质体、MTX负载脂质体或BSS假注射的IVI。在IVI后1、2、4和6周评估生物相容性。安乐死后，摘除眼球进行组织学处理。

所有操作均在动物麻醉下进行。玻璃体内注射使用30G微量注射器在睫状体平坦部进行。PLGA植入物通过 pars plana 的切口植入玻璃体腔。在植入后24、28、72小时以及1、2、4和6周进行前房房水穿刺。

生物相容性检测包括眼内压测量、眼底摄影、光学相干断层扫描（OCT）和视网膜电图（ERG）。组织学上，对眼球进行冰冻切片，进行H&E染色和CD45、Iba1、GFAP的免疫组化染色，以评估炎症和胶质细胞活化。

使用Prism 10进行统计分析。使用Kolmogorov-Smirnov检验评估正态性。酌情应用配对或非配对t检验。数据以平均值±SEM表示（除非另有说明）。P值小于0.05被认为具有统计学意义。