综述：3D生物打印在角膜组织工程中的应用：从生物墨水到临床转化

　　这篇综述系统总结了3D生物打印技术在角膜组织工程中的最新进展，重点探讨了生物墨水设计（如GelMA、胶原蛋白、dECM）、打印方式（EBB、SLA、DLP）及其在模拟角膜透明度、机械性能和生物功能方面的突破。文章深入分析了角膜结构仿生（如胶原纤维排列）、关键挑战（细胞活性、血管生成控制）及临床转化前景（如角膜植入物、基因治疗），为再生医学和个性化医疗提供了重要参考。

　　

3.1 角膜组织工程的关键生理特性

角膜的应力响应受其组成层和结构亚成分的复杂组织影响，这些共同定义了角膜的生理和生物学特性，包括透明度、生物力学特性、血管生成、肿胀、降解、胶原纤维排列和渗透性。角膜透明度取决于胶原纤维的精确排列和间距，以及内皮对水合的调节。角膜生物力学考虑眼压、角膜刚度和粘弹性。血管生成破坏了角膜的无血管性质，损害透明度。肿胀由渗透性变化或酶活性驱动，削弱结构完整性并损害透明度。角膜形状对光折射至关重要，由其生物力学特性和ECM组织维持。

3.1.1 透明度

角膜透明度可定义为角膜传输光的能力。透明度受基质厚度、胶原纤维排列、上皮屏障完整性和内皮正常功能（维持天然角膜中的液压平衡）控制。维持角膜透明度有助于眼睛健康和最佳视觉功能。角膜透明度的量化通过评估光通过角膜的透射率实现。根据主观分级量表（1-4），0分表示无混浊，4分表示几乎整个角膜表面被云化，因混浊而阻碍可视化。天然角膜中的光传输量化为百分比，角膜在450-600 nm波长下显示80-94%的光传输，在600-1000 nm波长下显示95-98%的光传输。角膜上皮和基质内的蛋白质和维生素对UVB和UVC辐射的吸收对眼睛起到保护作用。这种吸收显著减少了这些波长范围内的辐射传输，从而最小化潜在的细胞损伤。然而，传输在380 nm增加到80%，并在500-1300 nm范围内超过90%。Mahdavi等人记录了用于角膜构建物的明胶甲基丙烯酰基（GelMA）在400-1000 nm的透射率，发现12.5% GelMA在边缘达到80-95%的传输，中心达到78-90%的透射率，更接近天然角膜。尽管12.5% GelMA支架最初表现出与天然角膜相当的光学特性，但细胞封装后透明度随时间下降 due to proliferation and light scattering。此外，在蓝色光谱中 eosin Y的吸收可能进一步限制体内长期视觉性能，突出了优化光引发剂系统和延长验证的必要性。类似地，Bektas等人获得了15% GelMA在（250-700 nm）高于80%的透射率，除了第1天的细胞加载平板。虽然支架表现出良好的透明度、机械稳定性、体外细胞相容性，但仍需要全面的体内研究来确认其在角膜环境中的长期功能和整合。Zhang等人证明，脱细胞细胞外基质（dECM）/GelMA（10%）的组合在780 nm具有≈90%的优异透射率，10% GelMA。有趣的是，存在人角膜成纤维细胞时透射率增加了≈14%。尽管dECM/GelMA水凝胶显示出有希望的短期透明度，但它们的光透射率低于纯GelMA（≤≈86% above 500 nm，在蓝紫色范围减少），且在生理条件下的长期光学清晰度未经测试。此外，打印的角膜比天然组织厚（≈900 vs. 500-550 μm），这可能改变折射性能，但未评估体内波前或折射结果。此外，He等人报告，在PEGDA/GelMA中，10%聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEGDA）的较低浓度在600 nm具有更高的透明度（≈91%） compared to higher concentrations。这种透明度水平超过了天然角膜，突出了PEGDA/GelMA水凝胶用于CTE应用的潜力。在另一项研究中，Kutlehria等人配制了由明胶（4%）、海藻酸钠（3.25%）和胶原蛋白（5%）组成的生物墨水，打印的构建物在400-700 nm范围内达到75-90%的透射率。尽管体外透射率达到>75%，但生理条件下的光学清晰度未经测试。因此，需要评估长期透明度、组织整合和折射结果的体内研究。在另一项研究中，Zhang等人使用海藻酸钠（0.02 g mL^?1）和明胶（0.10 g mL^?1）的组合，在可见光谱中达到85-94%的透射率。该研究还证明，打印的构建物具有屏蔽组织免受辐射的潜力， due to their lower UV band transmittance。

临床上，维持角膜透明度对于角膜替代物至关重要。UVA/核黄素角膜交联，尽管在基质内创建键， largely preserves optical clarity in the long term because it does not significantly alter collagen interfibrillar spacing。临床上， transient stromal haze may occur in the first weeks of the postoperative period，通常归因于角膜细胞凋亡和修复过程，但随着基质重塑和重新填充，角膜通常在随后的几个月恢复其完全透明度。在水肿角膜中，如那些受大疱性角膜病变影响的角膜，角膜交联可能通过压实肿胀的基质板层诱导透明度的短暂改善。然而，这种效果是暂时的，除非解决 underlying endothelial pump dysfunction。生物工程交联角膜植入物在适当设计时也可以实现高光学性能。酶交联蛋白质水凝胶（使用HRP或转谷氨酰胺酶）形成相对均匀的聚合物网络， minimize light scattering and can achieve transparency comparable to native corneal tissue。例如，通过HRP/H₂O₂交联的胶原蛋白或丝素蛋白水凝胶在体外保持与正常角膜相当的光学透明度。另一方面，某些化学交联剂，如戊二醛，可以由于聚合醛残基而引入 transient coloring or haze to collagen scaffolds，导致淡黄色调。类似地，光敏剂如核黄素或玫瑰 Bengal can initially cause stromal light scatter。这些光学副作用 tend to diminish over time with proper post-processing techniques，如洗涤或淬灭，去除残留交联剂并消除雾度或发色团而不损害机械完整性。例如，用EDC和戊二醛双交联的支架，当用淬灭剂处理以中和游离醛时，保持与对照一样清晰。在体内，透明度的早期减少（来自水肿、细胞损失或炎症）通常随着移植物整合而解决。最终，成功的交联方案产生既强又透明的角膜组织，履行角膜作为眼睛主要折射窗口的作用。

大多数关于角膜基质透明度的生物打印研究已达到与天然角膜相当甚至超过的水平。然而，创建完全功能的角膜需要合并 additional layers，包括无细胞和细胞层，以复制整个结构。然而，这些层的包含， primarily cell-based，可以显著影响透明度。具体来说， poorly differentiated cells and abnormal multilayering can increase light scattering and reduce transparency。相反，平滑、汇合和 well-differentiated的上皮细胞层可以通过最小化表面光散射来维持甚至增强透明度。类似地，细胞控制的ECM沉积在维持透明度中起关键作用。虽然 organized ECM deposition supports transparency， excessive or misaligned ECM, cellular debris, or disorganized structures can lead to increased light scattering and diminished optical clarity。此外，角膜某些区域较高的细胞密度可以影响光传输。在这种背景下，3D生物打印提供了一个强大的工具来控制细胞沉积，包括细胞密度和空间排列。这种精确的组织不仅支持最佳光传输，而且可以积极影响细胞分化和组织再生，有助于人工角膜的整体功能。

3.1.2 机械特性

机械特性在决定角膜形状和功能方面起关键作用。理解机械特性如何影响角膜形状 since the growing number of refractive surgeries since 90s。视觉可以受到由疾病、创伤或手术导致的机械特性改变的显著影响。影响角膜生物力学的主要因素包括厚度、曲率和胶原纤维的组织。其中，角膜厚度在定义其生物力学特性中起关键作用（上皮≈50 μm，基质500 μm，内皮5-10 μm）。较薄的角膜往往表现出 reduced elasticity and are susceptible to deformation when exposed to external forces，而较厚的角膜通常具有更高的刚度和更大的抗变形能力。此外，较薄的中心角膜可以通过影响眼内压（IOP）读数增加青光眼风险， potentially delaying diagnosis, and leading to more advanced disease stages。根据一项研究，中心角膜厚度10 μm的差异可能导致IOP变化0.18至0.49 mmHg。此外，研究证明，角膜曲率的变化可以影响其生物力学反应。例如，与较陡的角膜相比，较平的角膜可能更容易变形。

角膜的粘弹性特性在定义其机械行为方面至关重要， resulting from the interplay of various structural components，包括胶原纤维和由聚阴离子、亲水性 ground substance组成的凝胶状基质。作为粘弹性材料，角膜表现出弹性（可恢复）和粘性（时间依赖）响应机械应力，如IOP和外部机械载荷。这种双重行为允许角膜在施加的力下变形，并逐渐恢复其原始形状，从而确保结构弹性。角膜内的胶原提供弹性 to the cornea。胶原纤维的直径、间距和方向显著影响角膜生物力学。同时，粘弹性行为，归因于胶原的拉伸特性，使角膜能够有效吸收和消散机械能。这种相互作用确保角膜在适应动态力时保持其形状和光学清晰度，突出了胶原微观结构在其机械强度和粘弹性中的重要性。

人角膜的平均拉伸强度为3.81±0.40 MPa。Ulag等人报告，13%聚（乙烯醇）（PVA）打印构建物显示≈40 MPa的拉伸应力，而13% PVA/5%壳聚糖构建物显示≈9 MPa。尽管这些值表明增强的机械鲁棒性，但研究中未提供与天然角膜组织机械特性的直接比较。这种缺失的比较使得评估 such high-strength corneal substitutes的生理相关性变得困难。这是因为比天然角膜更硬的构建物可能损害生物整合，这对角膜功能同样关键。角膜细胞，角膜细胞，对基质刚度高度敏感。在其天然、顺从的ECM中，角膜细胞保持静止。如果环境变得异常僵硬，这些细胞可以转化为修复表型（成纤维细胞/肌成纤维细胞），产生瘢痕组织。这种现象在角膜纤维化中有充分记载，其中 post-injury stroma often stiffens due to disordered ECM deposition，并促进 transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1)-driven keratocyte-to-myofibroblast transformation。此外，一些研究报告体积拉伸或压缩特性，这些通常在静态和单向加载条件下进行。这些测试结果的重要性与天然角膜的深度依赖、各向异性和粘弹性机械行为相比不足。尽管报道了用于CTE的高机械强度角膜构建物，但从商业人工角膜（keratoprostheses）的见解说明了机械不匹配的相关风险。传统KPro设备用刚性材料制造，如聚甲基丙烯酸甲酯， possess tensile stiffness far exceeding compared of the native cornea。虽然PMMA本身是生物惰性的，但其缺乏灵活性和 poor tissue adhesion often lead to integration failure at the junction between the device and host tissue。交联前基质的 high stiffness causes initial keratocyte apoptosis in that region and stimulates an inflammatory cascade。临床上，这在角膜胶原交联后表现为 transient stromal haze。这些观察强调了设计具有紧密模仿天然组织的生物力学特性的角膜替代物的重要性，以支持结构功能和生物整合。

此外，水合对水凝胶基材料的机械行为也有显著影响。例如，研究证明，水凝胶在完全水合时表现出显著降低的刚度 compared to their dry or partially hydrated states，强调了在生理相关湿度条件下评估机械性能的必要性。认识到水合影响机械特性， several studies pre-hydrate their samples before conducting mechanical tests。例如，在一项研究中，在37°C PBS中浸泡2小时的水凝胶仍然表现出高拉伸、压缩和缝合保留强度。另一项研究评估了更长时间PBS孵育（最多21天）后的构建物，拉伸强度达到3.42±0.22 MPa，并在3周后保持超过2.1 MPa。在另一项研究中，Campos等人确定了生物墨水的压缩模量，其中0.5%琼脂糖和0.2% I型胶原，交联前为≈18 kPa。然而，它仍然低于天然人角膜基质的压缩模量，据报道全厚度平均压缩模量≈38 kPa，但也根据解剖深度不同。Zhang等人报告，将dECM（来自猪角膜）浓度增加到1%（w/v）将构建物的压缩强度增加到≈74 kPa。这 primarily be attributed to enhanced intermolecular interactions and cross-linking within the composite bioink。ECM成分，包括胶原、GAG和其他基质蛋白，可能通过促进更密集的网络形成、改进的结构完整性和更大的抗压能力提供额外的机械增强。根据文献，角膜的杨氏模量在27岁时为0.27 MPa，到100岁时增加到0.52 MPa。此外，角膜杨氏模量的体外测定变化显著，范围从0.1到57 MPa， likely due to differing experimental conditions。此外，具有ECM的构建物的杨氏模量为≈27 kPa，表示与没有ECM的构建物相比增加≈33%。这种增强使构建物的杨氏模量更接近天然角膜范围值的下端。

尽管有这些改进，仍然需要增强机械特性 alongside other key characteristics的材料。几种方法可以改善这些特性。例如，颗粒微凝胶可以帮助改善构建物的机械特性 whilst maintaining transparency。一个有前途的例子涉及使用小的均匀颗粒微凝胶， which showed improved bioprintability while preserving optical clarity。在研究中，颗粒聚轮烷（GPR）微凝胶通过微凝胶堵塞和α-环糊精（αCD）介导的超分子交联形成密集填充和机械互锁网络，增强了构建物的机械特性。此外，微凝胶的颗粒性质提供自愈合和注射后快速形状恢复，导致更强、更有弹性和易于注射的材料 compared to traditional corneal biomaterials。

交联方法，包括共价、离子和动态交联，可以提高强度、刚度、自愈合和弹性。临床角膜胶原交联与UVA/核黄素已被广泛验证以显著增加基质刚度，通过加固角膜停止 ectatic diseases的进展。机械测试显示，用完整德累斯顿角膜交联方案（核黄素+葡聚糖+UVA）处理的角膜表现出与仅用葡聚糖处理的角膜相比 tangent modulus增加≈28±17%，表明 stiffening effect arises specifically from UVA-activated cross-linking rather than osmotic dehydration alone。类似地，用于CTE的仿生生物工程交联方法同样证明了机械强度的增强。酶交联剂如转谷氨酰胺酶催化胶原分子之间共价键的形成（模仿体内天然赖氨酰氧化酶介导的交联），并已被显示使胶原构建物变硬。例如，转谷氨酰胺酶诱导的交联在胶原水凝胶和角膜中可以增加机械刚性而不需要UV光，一种在兔子模型中测试的方法。在1.5 MPa应力下，转谷氨酰胺酶交联增加角膜刚度≈1.5倍 compared to UVA/riboflavin (29.8 vs. 20.5 MPa)。类似地，辣根过氧化物酶（HRP）与H₂O₂可以在蛋白质基支架中诱导二酪氨酸交联，产生 both mechanically tunable and elastic的水凝胶。这些交联策略提供 immediate improvement in graft mechanical stability and suturability，并且它们的效果 tend to persist long-term due to the permanence of the induced collagen cross-links。事实上，UVA/核黄素角膜交联的长期研究 in vivo confirm that the cornea remains biomechanically strengthened years after treatment，随着组织适应而 slight flattening of curvature。重要的是，虽然增加交联密度通常有利于强度和酶抗性， excessive cross-linking may lead to matrix compaction or depletion of lysine residues critical for cell adhesion。因此，寻求最佳交联度以确保强 yet biologically accommodating grafts。此外，最近的研究强调了战略设计的交联方法，包括共价、离子和动态交联，如何可以提高角膜生物材料的强度、刚度、自愈合和弹性。Rizwan等人证明，GelMA的顺序物理和UV共价交联产生机械强度八倍增加，允许构建物承受手术力而不破裂。然而， such hybrid systems aimed to increase stiffness may compromise their flexibility。相比之下，Wei等人使用可逆希夫碱键用于动态自愈合水凝胶，实现可调强度和快速机械恢复。这些凝胶还表现出对天然角膜的强粘附特性以及体内治疗益处。氧化结冷胶（2.0 wt.%）/羧甲基壳聚糖（1.5 wt.%）配方表现出最高的组织粘附（33.5 kPa）和剪切强度（7.1 kPa），表示与1%配方相比60-70%的改善。这种增强是由于较高的氧化结冷胶浓度，提供了更多的醛基，形成更多的希夫碱键与组织氨基，从而加强粘附。类似地，Li等人使用多模式交联策略设计了一个机械鲁棒和光学透明的补片，包括UV诱导聚合、动态希夫碱化学和UVA/核黄素介导的临床角膜交联。这种双网络架构在 burst pressure and tensile strain方面显著优于单交联（仅UV）水凝胶。拉伸应变达到500-600% for the GelMA + Pluronic F127 diacrylate (F127DA) + aldehyde-functionalized Pluronic F127 (AF127) + 3% collagen type I formulation (G8F4C3)， compared to <50% for GelMA-only (G12) and ≈120% for GelMA + F127DA (G8F4)。这些改进源于共价交联对结构完整性的协同贡献、动态希夫碱键用于能量耗散和自愈合（拉伸伸长从G8F4中的≈120%增加到G8F4C3中的≈500-600%）和UVA/核黄素交联用于增强组织粘附（burst pressure >400 mmHg ≈ 53 kPa for G8F4C3 with UVA/riboflavin and ≈20 kPa for typical UV-only GelMA hydrogels，搭接剪切强度在G8F4C3 with UVA/riboflavin中也最高）和生物力学相容性（拉伸模量在G8F4C3 with UVA/riboflavin中增加到≈60 kPa and ≈40 kPa in G8F4，压缩模量改善，即使在 high strain也无损伤，不像UV-only GelMA在50%应变前失败）。这些互补机制共同导致显著 superior mechanical strength, elasticity, toughness, and resilience，突出了交联设计作为工程高级角膜构建物的强大杠杆。添加化学基团如儿茶酚可以增强粘附性和韧性。这些策略提供了有效的方法来加强材料而不损害基本特性。生物打印可以通过实现对材料组成和结构的精确控制来增强人工角膜的机械特性。通过生物打印，材料可以精确沉积以模仿天然角膜的天然分层架构。这种技术允许对构建物内每一层的特性进行 meticulous control。生物打印的精度还使得能够将微或宏观纤维整合到水凝胶基质中， improving load-bearing capacity and mechanical anisotropy。此外，生物打印可以增强材料内细胞结构的排列，优化长期角膜功能所需的机械特性。因此，生物打印提供了一个强大的工具来设计和制造具有 superior mechanical properties tailored to mimic natural corneal tissue的人工角膜。

3.1.3 血管生成

角膜血管生成的特征是新血管从角膜缘浸润到角膜。这种现象是由于促血管生成因子（如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和血管生成素）与抗血管生成因子（如色素上皮衍生因子（PEDF）、血小板反应蛋白和内皮抑素）之间的平衡紊乱引起的。这种平衡对于维持角膜透明度至关重要，通过防止不需要的血管生长到通常无血管的角膜中。不成熟的血管生成可能导致脂质损失、慢性炎症和瘢痕组织形成，这对角膜的透明度和视力构成风险。对于3D生物打印的角膜移植物，血管生成是构建物成功的重要特征之一。例如，植入的PEGDA/GelMA水凝胶在成年雄性兔子中没有引起任何炎症和血管生成。然而，Bektas等人观察到在将GelMA植入角膜中部基质袋后第一周深度血管生成。在用单剂量结膜下抗血管内皮生长因子（VEGF）药物治疗后，他们观察到血管生成显著减少