基于无标记光学生物传感器的细胞粘附动力学原位监测：评估天然化合物的抗癌潜力与选择性

　　本文推荐一篇利用无标记光学生物传感器（如RWG和全息显微镜）实时监测天然化合物抗细胞粘附效应的前沿研究。该工作通过分析11种纯化合物与4种粗提物对癌细胞（HeLa）和健康细胞（前成骨细胞）的粘附抑制效应，揭示了芳基四氢萘木脂素（如DPT、APT）通过不可逆结合纤连蛋白（fibronectin）发挥非选择性抗粘附作用，而新木脂素balanophonin和生物碱vermelhotin则通过细胞直接作用实现选择性抑制。该方法为快速筛选具有抗癌潜力的天然化合物提供了高通量、无标记、实时动态分析新策略。

　　

1 INTRODUCTION

天然小分子在医学尤其是癌症治疗中扮演关键角色。1981至2019年间，41%的注册小分子抗癌药物源于天然产物。无标记生物传感器为天然化合物筛选提供了强大工具，能够实时、连续监测其对细胞过程的影响，克服传统终点检测法的局限。共振波导光栅（RWG）和全息显微镜等技术可动态评估细胞粘附、迁移和信号转导，为揭示药物候选物的作用机制提供深入见解。

木脂素衍生物如依托泊苷和替尼泊苷是代表性抗癌药物，均为高毒性木脂素鬼臼毒素的半合成衍生物。鬼臼毒素通过结合微管蛋白抑制癌细胞有丝分裂，但缺乏选择性，对健康细胞同样有毒。因此，寻找活性更高、毒性更低的类似物并阐明其作用机制至关重要。木脂素基本结构由两个苯丙烷单元通过C8–C8′连接构成，包括芳基四氢萘木脂素（如鬼臼毒素衍生物）和二苄基丁内酯木脂素等亚型。

本研究聚焦从植物和真菌来源分离的11种纯天然化合物（代表四种不同结构类型）和4种粗提物，采用RWG和全息显微镜技术，实时分析它们对癌细胞（HeLa）和健康细胞（前成骨细胞）在纤连蛋白涂层和聚苯乙烯表面的粘附动力学与形态参数，并探究其与纤连蛋白的相互作用。

2 MATERIALS AND METHODS

2.1 植物提取物制备与化合物分离

采用二乙醚和甲醇分步提取鹅不食草（Anthriscus sylvestris）和光亮鹅不食草（A. nitida）根部，获得粗二乙醚提取物（CDEE）和粗甲醇提取物（CMEE）。通过制备型HPLC分离纯化木脂素类化合物如去氧鬼臼毒素（DPT）、天使酰鬼臼毒素（APT）和无水鬼臼脂醇（AHP）。

2.2 分析鉴定与定量

运用HPLC-DAD和Orbitrap高分辨质谱（HR-MS/MS）鉴定和定量提取物中的化合物。外标法测定DPT、APT、AHP和绿原酸的浓度，线性回归分析显示良好相关性（r² > 0.997）。

2.3 细胞培养与粘附实验

HeLa细胞和前成骨细胞（MC3T3-E1）在标准条件下培养。粘附实验采用HBSS-HEPES缓冲液（pH 7.0）。化合物和提取物用DMSO溶解后系列稀释用于测试。

2.4 RWG生物传感器检测

使用Corning Epic BT系统监测细胞粘附动力学。该技术通过测量传感器共振波长偏移（Δλ）反映细胞质量分布或生物分子吸附引起的折射率变化。实验在384孔纤连蛋白涂层板中进行，包括化合物吸附、洗涤及细胞添加等步骤，实时记录信号变化。

2.5 全息显微镜分析

采用Holomonitor M4系统无标记监测细胞形态和运动参数，如细胞面积、平均光学厚度、迁移和运动速度。实验在96孔板中进行，每5分钟采集图像，持续2小时。

2.6 MTT细胞活性检测

通过MTT法评估化合物短期（3小时）和长期（24小时）的细胞毒性和细胞抑制效应，计算IC₅₀值。

3 RESULTS AND DISCUSSION

3.1 粗提物化合物鉴定

CDEE和CMEE中主要成分为DPT、APT和AHP。CDEE中木脂素含量约为CMEE的20倍，且CMEE富含绿原酸（CA）衍生物。AN-CDEE和AN-CMEE中同样检出DPT、去甲氧基DPT及二苄基丁内酯木脂素。

3.2 RWG生物传感器粘附测定

3.2.1 化合物存在下的细胞粘附

芳基四氢萘木脂素DPT和APT对HeLa和前成骨细胞均显示显著粘附抑制（约40%–50%），且无浓度依赖性。二苄基丁内酯木脂素AHP抑制作用较弱但呈浓度依赖。粗提物AS-CDEE、AS-CMEE、AN-CDEE和AN-CMEE均表现出抗粘附活性，主要归因于DPT和APT含量。新木脂素balanophonin和生物碱vermelhotin对HeLa细胞有选择性抑制，且不与纤连蛋白相互作用。其他化合物如松脂醇、绿原酸衍生物等无显著活性。

3.2.2 洗涤后细胞粘附

洗涤后，除DPT外，多数纯化合物活性显著降低。粗提物AS-CDEE和AN-CDEE活性保持稳定，而AS-CMEE和AN-CMEE活性下降，提示低含量木脂素经洗涤后效应减弱。

3.2.3 化合物与纤连蛋白结合

DPT、APT、AHP及粗提物与纤连蛋白呈不可逆结合（信号偏移 > 100 pm），而balanophonin和vermelhotin无结合。CA衍生物如acteoside和isoacteoside也显示强结合能力。

3.3 全息显微镜分析

Balanophonin和vermelhotin处理导致HeLa细胞变圆、面积减小、厚度增加，证实其对聚苯乙烯表面的直接抗粘附作用。DPT、APT及粗提物未引起形态变化，表明其效应依赖纤连蛋白介导。

3.4 MTT细胞毒性

3小时处理无细胞毒性；24小时后，所有化合物均显示细胞毒/抑制效应。DPT和APT对两种细胞无选择性（IC₅₀ ≈ 0.2 μM），而balanophonin和vermelhotin具有限选择性（IC₅₀：10–30 μM）。

4 CONCLUSIONS

无标记生物传感器技术可快速筛选天然化合物及复杂提取物，实时监测其对癌细胞和健康细胞粘附的抑制效应。芳基四氢萘木脂素通过不可逆结合纤连蛋白发挥非选择性抗粘附作用，而balanophonin和vermelhotin通过直接细胞作用实现选择性抑制。该方法为发现抗癌先导化合物提供了高效、动态的分析平台，但需进一步在多细胞系和原代细胞中验证，并结合力学检测技术（如纳米电穿孔-DNA张力平台）深化机制研究。