TIM-3与STAT-3协同沉默：基于siRNA纳米载体的肿瘤免疫治疗新策略

　　本研究针对肿瘤微环境中免疫检查点TIM-3和信号转导因子STAT-3协同促进肿瘤进展的难题，开发了壳聚糖乳酸纳米载体共递送Tim-3/STAT-3 siRNA的基因沉默策略。体外和鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验证实，该策略通过下调BCL-2、上调BAX显著诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制MMP-2/9介导的迁移和VEGF/TGF-β/FGF相关的血管生成，首次揭示了Tim-3与STAT-3在肿瘤细胞内在功能中的协同作用，为免疫检查点与致癌通路联合靶向治疗提供了新范式。

　　

癌症作为遗传性疾病，其治疗始终面临肿瘤微环境复杂性和免疫系统功能受损的挑战。尽管免疫检查点抑制剂（ICI）如PD-1/CTLA-4单抗已取得突破，但多数患者仍产生适应性抵抗。T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域-3（TIM-3）作为新兴免疫检查点，不仅参与T细胞耗竭，更直接通过STAT-3/NF-κB通路促进肿瘤增殖、转移和血管生成，而STAT-3作为致癌转录因子，可调控细胞周期蛋白（如CCND1）、凋亡因子（如Bcl-2）及血管生成因子（如VEGF）的表达。两者形成的正反馈环路成为联合靶向的理论基础。

为验证协同沉默的抗肿瘤效果，研究团队采用壳聚糖乳酸纳米载体（Chitosan lactate nanoparticles）共包裹Tim-3和STAT-3 siRNA，转染 murine 来源的4T1（乳腺癌）和CT26（结直肠癌）细胞系，并通过鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型进行体内外验证。关键技术包括：siRNA纳米载体构建（离子凝胶法）、qPCR/mRNA检测、蛋白质水平基因敲低试剂盒（QuantiSir）、MTT法细胞活力检测、Caspase-3活性测定、伤口愈合实验、集落形成实验及CAM血管生成分析。

细胞活力与凋亡受TIM-3/STAT-3沉默影响

MTT实验显示，双沉默组24小时和48小时细胞活力抑制率（4T1:57.43%/75.42%；CT26:63.53%/77.60%）均超越预期加和效应，证实协同作用。凋亡检测中，双沉默组BAX mRNA/protein显著上调，BCL-2下调，Caspase-3活性最高（p<0.05），表明凋亡通路被激活。

mRNA与蛋白水平验证基因沉默效果

qPCR和基因敲低试剂盒证实：双沉默组Tim-3 mRNA抑制率（4T1:68.51%；CT26:80.66%）和STAT-3 mRNA抑制率（4T1:82.08%；CT26:78.82%）均高于单沉默组，蛋白水平抑制趋势一致，且观察效应均超过预期加和值。

克隆形成能力被协同沉默抑制

集落形成实验显示，双沉默组集落数量减少最显著（4T1抑制率47.91% vs 预期37.27%；CT26抑制率53.95% vs 预期43.73%），表明增殖能力受协同抑制。

TIM-3/STAT-3阻断抑制体内外肿瘤生长

CAM实验中，双沉默组肿瘤重量最小，血管生成相关因子VEGF、TGF-β、FGF的mRNA表达最低（观察抑制率均超预期值），证明其抗血管生成效果。

迁移能力被纳米载体-siRNA复合物削弱

伤口愈合实验和MMP-2/9检测表明，双沉默组细胞迁移率和MMP-2/9 mRNA/protein表达最低（MMP-2抑制率4T1:69.60% vs 预期50.77%；MMP-9抑制率4T1:71.07% vs 预期49.81%），提示转移潜能受抑制。

本研究结论表明，Tim-3与STAT-3在肿瘤细胞中存在功能协同性，其共沉默可通过诱导凋亡、抑制增殖、血管生成和迁移实现协同抗肿瘤效果。壳聚糖乳酸纳米载体作为高效siRNA递送系统，为基因沉默治疗提供了转化前景。讨论部分强调，尽管CAM模型证实了抗血管生成和肿瘤消退效果，但完整免疫微环境的缺失限制了免疫检查点功能的评估，未来需在免疫健全的动物模型中验证免疫细胞重编程作用。该策略有望克服PD-1单抗耐药性，为TIM-3/STAT-3轴靶向治疗提供临床前证据。

（论文发表于《BMC Cancer》，作者：Reza Karami^1,2、Shahla Khodayari¹等，通讯作者：Farhad Jadidi^1,2,7*）