基于微流控液滴角度分辨光散射成像的多重快速表型抗生素药敏检测技术

　　针对多药耐药菌感染亟需快速、高通量表型药敏检测的临床挑战，本研究开发了一种整合微流控液滴、二维角度分辨光散射成像（2D ARS）和荧光编码的多重快速AST平台。通过卷积神经网络分析单细胞生长特征，仅3小时孵育即可实现与金标准方法95%的分类一致性，显著缩短检测时间5-17小时，为精准抗菌治疗提供关键技术支撑。

　　

随着多重耐药菌的持续蔓延，全球正面临"后抗生素时代"的严峻挑战。世界卫生组织（WHO）将抗生素耐药性列为十大全球公共卫生威胁之一，若不采取有效措施，预计到2050年耐药感染将导致每年约1000万人死亡，超过癌症的死亡人数。当前临床标准的抗生素敏感性试验（AST）方法如纸片扩散法和肉汤微量稀释法虽可靠性高，但需8-20小时的孵育时间，严重延误重症感染患者的精准治疗。基因型AST虽能快速检测耐药基因，但无法涵盖孔蛋白缺失、外排泵等非基因型耐药机制，仍需表型检测作为金标准。

针对这一困境，德国莱布尼茨天然产物研究与感染生物学研究所的Martina Graf等人在《Journal of Advanced Research》发表研究，开发了一种基于微流控液滴技术的高通量多重快速AST平台。该平台通过荧光染料编码不同抗生素条件，结合二维角度分辨光散射成像（2D angle-resolved light scattering, ARS）技术实现单细胞水平生长监测，利用卷积神经网络（CNN）分析散射图像预测细菌浓度，最终通过统计模型判定药敏结果。

研究人员采用的关键技术包括：1）微流控液滴生成与荧光编码技术：通过红绿荧光染料组合创建多重抗生素条件编码系统；2）光路集成检测系统：耦合光纤荧光检测与2D ARS成像，采用660 nm激光光源和CMOS探测器矩阵捕获散射光信号；3）深度学习算法：使用EfficientNetV2-XL架构的CNN模型分析ARS图像预测细胞浓度；4）统计判定模型：基于对数正态分布拟合生长数据，通过互补误差函数计算敏感性概率。所有实验均使用已知耐药谱的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus

ARS成像设置

研究采用660 nm激光光源产生25 μm光斑，CMOS探测器矩阵可检测|θ_s,d|=37°对角线散射角和?_s=±180°方位角。通过光束阻断器屏蔽透射光束，bandpass滤光片消除荧光信号干扰，实现400-800 μs曝光时间的触发式ARS图像采集。

荧光检测系统

采用多模光纤导引408 nm、488 nm、561 nm三波长激光激发荧光，通过光电倍增管和四波段滤光片（440/521/607/700 nm）检测信号。锁相放大器按调制频率过滤信号，Python分析流程实现荧光信号与ARS图像的精准匹配。

微生物培养与微流控芯片

使用LB培养基培养4种S. aureus菌株（包括MRSA和MSSA），通过光刻技术制造SU8-2050光刻胶模具，PDMS软光刻制备微流控芯片。液滴生成采用流动聚焦结构（喷嘴50 μm），生成55-60 μm直径液滴，HFE7500油相含0.4% FluoSurf表面活性剂。

深度学习分析

采用EfficientNetB4模型过滤误触发图像，EfficientNetV2-XL模型进行回归预测。基于99th百分位数设定生长阈值，通过对数正态分布拟合生长数据，使用互补误差函数计算控制组与抗生素组的生长差异概率（≥0.8判为敏感）。

多重AST验证实验

通过荧光编码区分6种细胞浓度（OD₆₀₀ 0-3），DBSCAN聚类算法成功分离不同荧光信号群体。ARS图像分析显示预测值与实际OD呈正相关，证实多重检测可行性。

药敏检测性能

测试5种抗生素（PEN、GEN、CIP、ERY、TET）在EUCAST折点浓度下的效果。结果显示：

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  3小时孵育即达到与纸片扩散法95%分类一致性
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  相比VITEK 2缩短5-11小时，相比纸片扩散法缩短13-17小时
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  仅菌株4对CIP出现误判（因仅使用低折点浓度）
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  平台通量达20,000-40,000液滴/条件，可检测稀有耐药亚群

研究结论表明，该平台成功实现了多重快速表型AST检测，将检测时间缩短至3小时，与金标准方法高度一致。其创新性在于将微流控液滴的高通量优势与2D ARS成像的灵敏性相结合，通过荧光编码和深度学习算法实现多重条件的并行分析。该技术不仅能用于临床AST检测，还可应用于种群异质性研究、生长条件优化和罕见微生物检测等领域。未来需进一步验证其在其他病原体（包括厌氧菌）中的应用，并解决抗生素跨液滴转移的技术限制，以推动临床转化。

研究的重要意义在于为抗生素精准治疗提供了强有力的技术工具，有望显著减少广谱抗生素滥用，遏制耐药性发展，最终改善感染性疾病患者的治疗效果和生存预后。