基于ddPCR技术的AVGN7基因治疗在G?ttingen小型猪体内生物分布分析方法的开发与验证

　　本刊推荐：为解决基因治疗临床前研究中大型动物模型生物分布检测的标准化难题，研究团队开展了G?ttingen小型猪AVGN7（携带人源Smad7基因的AAV载体）生物分布ddPCR检测方法的全面验证。该研究建立了灵敏度达10 cp/μg gDNA的双重ddPCR检测体系，在线性范围、准确性、精密度、稳定性等参数上均符合监管要求，成功克服了猪组织样本回收率差异大的技术瓶颈，为AAV基因治疗产品的非临床研究提供了重要方法学支撑。

　　

随着基因治疗领域的快速发展，监管机构对临床前研究提出了更高要求，其中载体生物分布研究是支持新药临床试验申请（IND）的关键环节。尽管腺相关病毒（AAV）载体已成为基因治疗的主要递送工具，但大型动物模型的生物分布检测仍面临方法学标准化不足的挑战。特别是与传统实时荧光定量PCR（qPCR）相比，微滴式数字PCR（ddPCR）技术虽具有绝对定量、高灵敏度和抗干扰能力强等优势，但其在大型动物模型中的应用验证范例十分稀缺。

G?ttingen小型猪作为非人灵长类动物的替代模型，因其生理结构、药物代谢与人类高度相似，且伦理争议小、繁殖能力强，正逐渐成为基因治疗研究的重要平台。然而，猪组织样本中存在大量抑制剂，且不同组织间核酸提取效率差异显著，这对生物分布分析的准确性和重现性构成了严峻挑战。

针对上述问题，Agostinho G. Rocha等研究者在《The AAPS Journal》发表了题为"Validation of a G?ttingen Minipig Gene Therapy Biodistribution Assay for AVGN7 Using Droplet Digital Polymerase Chain Reaction"的研究论文。该团队开发并验证了首例用于定量检测AAV基因治疗产品AVGN7（携带密码子优化的人Smad7基因）在G?ttingen小型猪多组织中分布情况的双重ddPCR方法，同步检测猪RPP30参考基因进行标准化，为支持IND申报提供了符合良好实验室规范（GLP）要求的关键数据。

本研究采用Bio-Rad QX200 ddPCR系统，通过优化DNA提取方法（比较Precellys珠磨均质、手术刀机械粉碎等前处理方式，以及Qiagen与KingFisher提取系统的回收效率），确定了肝组织与全血的最佳提取方案。采用900 nM/250 nM浓度的hSmad7和RPP30引物探针组合，在59°C退火温度下建立双重检测体系，系统验证了方法的准确性（偏差率）、精密度（CV%）、检测下限（LOD）、耐用性、选择性、提取回收率、稀释线性及样本稳定性等参数。实验使用商业来源的G?ttingen猪基因组DNA（pgDNA）和质量控制（QC）样品，并纳入脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脊髓、性腺及全血等10余种组织基质进行方法学评价。

检测方法的开发优化

通过BLAST分析确认引物探针特异性后，系统滴定显示900 nM/250 nM浓度组合在低浓度QC水平表现最优（图1A）。RPP30检测体系在所有浓度下偏差率仅-3%至2%，且与hSmad7检测组分无相互干扰（图1B）。双重反应与单重反应效率一致，且pgDNA存在不影响扩增效率（图1C）。59°C退火温度可获得清晰的阳性/阴性微滴分群（图1D），HindIII酶切线性化处理虽增加阳性微滴分布但未能消除"雨状"现象，故后续采用未酶切模板（图1E）。

分析方法验证

hSmad7检测的动态范围为25,000-5 cp/μL，其中LLOQ（定量下限）为5 cp/μL， intra-assay与inter-assay总误差分别≤35.5%和≤4.3%（图2A-B）。RPP30在所有浓度下偏差率＜±5%，显示卓越的重复性（图2C-D）。肝组织与全血经优化提取方案（珠磨均质+ATL缓冲液+Qiagen柱提取）后，回收率提升3-12倍（图3A），总体回收率达55-85%（图3B）。选择性实验中，未加标样本均低于定量下限（BLOQ），而加标样本偏差率为0.3%至-22.3%，符合验收标准（图3C）。

灵敏度与稳定性

通过系列稀释确定LOD为0.625 cp/mL（相当于10 cp/μg DNA），且95%置信区间下限达0.3125 cp/mL（图4A）。稀释线性覆盖3-4个数量级，偏差率与CV均＜±5%（图4B-C）。特异性验证显示无非特异性扩增（图4D），样本经6次冻融循环或24小时室温放置后仍满足准确性要求（图4E）。

本研究成功建立了首例经全面验证的G?ttingen小型猪AAV生物分布ddPCR检测方法，解决了大型动物组织样本回收率变异大、抑制剂含量高的技术难题。该方法的灵敏度（10 cp/μg DNA）、准确性（偏差率＜±25%）和重现性（总误差＜35.5%）均达到国际生物分析共识标准，且RPP30内参基因的表现尤为突出，为猪模型基因治疗研究提供了理想标准化工具。

研究者特别强调了小型猪模型在基因治疗研究中的独特优势：其药物代谢酶谱、免疫应答特性与人类高度相似，且对AAV载体的毒理学反应可预测性高，已成功应用于视网膜疾病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化（ALS）等多种疾病的临床前研究。本研究建立的标准化方法不仅支持AVGN7治疗包涵体肌炎等肌肉萎缩性疾病的IND申报，更为行业提供了可推广的方法学开发框架。

值得注意的是，本研究通过系统优化组织提取方案，显著改善了肝（提高3-6倍回收率）和全血（提高12倍回收率）等难处理样本的检测性能，这一技术突破对准确评估AAV的肝趋向性和血液清除动力学具有重要意义。此外，研究证实样本可在室温稳定保存24小时并耐受多次冻融，极大提升了临床前实验的操作灵活性。

该成果标志着基因治疗生物分布分析标准化的重要进展，为采用大型动物模型的非临床研究提供了关键方法学支撑，对推进肌肉疾病基因治疗的临床转化具有重要价值。