针对Pkp2缺陷的基因疗法可减轻心脏纤维化：来自Pkp2敲除大鼠单细胞转录组学的见解

《MedComm》：Gene Therapy Targeting Pkp2 Deficiency Attenuates Cardiac Fibrosis: Insights From Single-Cell Transcriptomics in Pkp2-Knockout Rats

　　本研究发现心衰（HF）模型中 десmosomal 蛋白 плакохилин-2（PKP2）表达显著下调，通过AAV9-PKP2基因治疗可有效逆转纤维化进程，并调节纤维母细胞亚群和免疫细胞间通讯，为HF治疗提供新策略。

　　心脏衰竭（Heart Failure, HF）是一种多种心血管疾病终末期表现，通常表现为心脏结构重塑和功能障碍的临床综合征，其中心肌纤维化是疾病进展的重要标志。尽管HF的病因具有多样性，包括缺血性损伤、压力负荷增加和遗传性心肌病等，但它们在病理生理机制上存在共性，如心肌细胞凋亡、纤维化替代以及电机械不同步等。当前的治疗策略，如神经内分泌阻断（β受体阻滞剂、ACEI/ARB、ARNI、醛固酮受体拮抗剂）和利尿剂，主要提供症状缓解，却对阻止纤维化重塑的效果有限。因此，探索更具针对性的抗纤维化干预手段，成为改善HF患者预后的关键。

心脏的结构和功能依赖于多种复杂的细胞间连接，其中桥粒（desmosomes）在维持心肌细胞间黏附完整性方面起着至关重要的作用。桥粒通过核心结构蛋白（如plakophilins、desmoplakin、plakoglobin）与细胞骨架网络的动态相互作用，实现机械耦合。这些连接在心脏收缩的周期性机械应力下对保持心肌同步性至关重要，其功能障碍可能导致结构紊乱和电不稳定。虽然心脏衰竭与桥粒结构之间没有直接的因果关系，但在某些心肌病中，桥粒结构的异常可能参与HF的发病机制。例如，plakophilin-2（PKP2）是桥粒的核心组成蛋白之一，它不仅在维持心肌细胞间连接方面发挥关键作用，还通过调控Wnt/β-连环蛋白信号轴，影响心肌细胞的增殖、分化和存活。因此，PKP2在心脏生物学中具有多重功能。

在本研究中，我们通过人类诱导性多能干细胞（hiPSCs）建立了心脏类器官模型，并观察到在缺氧损伤的模型中，PKP2蛋白表达显著下降。进一步在HF大鼠和小鼠模型中，也发现PKP2表达减少。随后，我们通过AAV9载体进行PKP2的基因治疗，发现其不仅恢复了心脏组织中PKP2的表达，还显著减轻了纤维化进展。在HF小鼠模型中，AAV9-PKP2的给药能够抑制心肌纤维化并减缓疾病进程。单细胞RNA测序分析显示，在PKP2缺失的心肌组织中，病理性的纤维化心肌成纤维细胞（CFs）显著富集。机制研究表明，AAV9-PKP2的治疗可以将激活的CFs转化为静止的抗纤维化状态。整合的生物信息学分析进一步指出，蛋白酪氨酸磷酸酶受体C（Ptprc）是调控这一细胞重编程过程的核心调控因子。这些发现揭示了PKP2作为纤维化调控的关键分子，为开发针对HF病理纤维化的新型基因治疗策略提供了重要依据。

为了深入探讨PKP2在心脏功能中的作用，我们构建了PKP2敲除的大鼠模型，并通过AAV9-PKP2进行基因补充治疗。Western blot分析显示，敲除组中桥粒蛋白JUP的表达显著下降，而AAV9-PKP2治疗不仅恢复了PKP2的表达，还提高了JUP蛋白水平。随后的小动物磁共振成像（MRI）和超声心动图（echocardiography）结果显示，PKP2敲除导致左心室射血分数（LVEF）显著降低，左心室舒张末期容积（LVEDV）和收缩末期容积（LVESV）显著增加，而AAV9-PKP2治疗在一定程度上缓解了这些异常，这一趋势与超声心动图结果一致。这表明PKP2的缺失会损害心脏功能，从而导致HF表型。此外，对血清生物标志物的进一步分析表明，PKP2敲除导致NT-proBNP和cTnT水平显著升高，而AAV9-PKP2治疗显著降低了这些指标，提示PKP2的缺失增加了心脏负荷并导致心肌细胞损伤。同时，纤维化相关基因如Col3a1和Col1a2在PKP2敲除组中表达显著上调，而在治疗后则被下调，进一步支持了PKP2在抑制心肌纤维化中的作用。通过Masson染色分析，也观察到敲除组的心肌纤维化程度显著高于对照组，而治疗后纤维化明显减轻。

在评估AAV9-PKP2的长期安全性时，我们对注射AAV9-PKP2 24周后大鼠的肝、肾和肺组织进行了H&E染色。结果显示，这些关键器官中未观察到明显的炎症细胞浸润、组织坏死或其他显著的病理改变，提示AAV9-PKP2在体内具有良好的安全性。同时，对血清中C反应蛋白（CRP）、肌酐（Cr）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）等关键生物标志物的分析也表明，AAV9-PKP2治疗组的这些指标显著低于PKP2敲除组，进一步验证了该治疗策略的无毒性和有效性。

为了研究AAV9载体在心脏组织中的表达持续性，我们对注射AAV9-PKP2后的不同时间点（1、2、3、4、6、8、12、24、48周）的大鼠心脏组织进行了zsGreen免疫荧光染色分析。结果显示，注射后6周即可在心肌组织中检测到显著的zsGreen表达信号，并且这种表达在整个研究期间保持稳定，直到48周的终点仍能观察到明显的表达信号。这表明AAV9载体在心脏靶向基因治疗中能够实现长期稳定的转基因表达，为治疗慢性心血管疾病提供了重要的理论基础。

我们还利用BD Rhapsody平台对心脏组织的细胞亚群变化进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。通过批处理校正和聚类分析，我们识别出五种不同的细胞亚群，包括心肌细胞（由Myh6、Tnnt2、Myl3和Myl2标记）、内皮细胞（由Ptprb、Nrp2和Poglut2标记）、成纤维细胞（由Col3a1和Cdh11标记）、平滑肌细胞（由Abcc9标记）以及免疫细胞（由Ptprc和S100a9标记）。在PKP2敲除组中，成纤维细胞和免疫细胞的比例显著增加，而心肌细胞的比例则减少。这提示PKP2的缺失可能通过改变细胞亚群比例和功能，促进纤维化进程。

为了进一步揭示PKP2相关治疗机制，我们对心肌细胞亚群进行了基因表达分析。与野生型和AAV9-PKP2治疗组相比，PKP2敲除组中多个基因表达上调，这些基因主要涉及钙离子结合、紧密连接以及细胞骨架稳定等过程。同时，心肌细胞中与心肌细胞组成和缺血诱导相关的基因表达则被显著下调。这表明PKP2在维持心肌细胞功能和结构完整性方面具有重要作用。

在免疫细胞亚群中，PKP2敲除组表现出多个基因的显著上调，这些基因涉及T细胞迁移、自然杀伤细胞分化、白细胞细胞间黏附以及Wnt信号通路的正向调控等。这些结果表明，PKP2在调控心脏细胞异质性方面具有重要作用，并为理解其在心脏病理中的保护机制提供了新的视角。此外，我们还发现，在PKP2敲除组中，成纤维细胞亚群中富集了多个与静止/稳态成纤维细胞和细胞外基质（ECM）降解相关的基因，而其他亚群如F-WntX和F-Trans则表现出更高的激活状态。这提示PKP2可能通过调控成纤维细胞的亚群比例和功能，对心脏纤维化起到抑制作用。

为了进一步研究成纤维细胞亚群的动态变化和转化过程，我们进行了伪时间分析。结果表明，PKP2敲除组中CF04亚群（F-Trans）在疾病后期显著富集，而AAV9-PKP2治疗能够逆转这一变化，将激活的成纤维细胞重新转化为静止状态。这表明PKP2在调控成纤维细胞激活方面具有关键作用，并为其在治疗心脏纤维化中的潜力提供了有力支持。

我们还通过CellChat算法分析了免疫细胞与成纤维细胞之间的细胞通讯。结果发现，PKP2敲除组中，表达Ptprc的免疫细胞与表达CD22的成纤维细胞之间的通讯显著增强。Ptprc（即CD45）是一种膜结合的酪氨酸蛋白磷酸酶，其表达水平在PKP2敲除组中显著升高。CD22作为抑制B细胞受体介导的信号传导的关键分子，其功能受到Ptprc的调控。此外，CF04亚群（F-Trans）中Ptprc和Apoe的表达显著升高，而治疗后则被下调。这表明Ptprc可能通过调控Apoe和CCDC80，影响成纤维细胞的激活和身份转换。因此，AAV9-PKP2的治疗效果可能与调控CD45和CD22之间的相互作用有关，从而干预HF诱导的纤维化过程。

尽管本研究揭示了PKP2在心脏纤维化中的重要作用，并验证了AAV9-PKP2作为基因治疗策略的潜力，但仍存在一些局限性。例如，我们尚未明确PKP2-CD45调控轴的具体作用机制，是PKP2直接调控CD45的表达，还是通过特定的信号通路间接影响？此外，是否通过改变mRNA稳定性或蛋白质降解来实现这一调控？这些问题需要在未来的实验中进一步研究。同时，对单细胞数据的深入分析也是必要的，这包括对表达CD45的特定免疫细胞亚群进行基因表达分析和细胞通讯变化的研究，以识别可能的调控因子或间接调控通路。这些研究将为开发基于PKP2调控轴的HF免疫治疗策略提供坚实的理论基础和精准的靶点。

综上所述，本研究发现PKP2在HF模型中表达显著下调，并通过单细胞测序揭示了其在调控心脏细胞异质性和纤维化过程中的关键作用。同时，AAV9-PKP2作为基因治疗手段，不仅能够恢复PKP2的表达，还能显著改善心脏功能并抑制纤维化进程。这些发现不仅加深了我们对HF病理机制的理解，还为开发针对HF的新型治疗策略提供了重要的理论支持和实验依据。未来的研究可以进一步探索PKP2-CD45调控轴的具体机制，以期为HF的治疗提供更加精准和有效的解决方案。