角蛋白细胞自噬介导的自组装四面体框架核酸可促进伤口愈合并减少疤痕增生

《MedComm》：Keratinocyte Autophagy-Mediated Self-Assembling Tetrahedral Framework Nucleic Acid Induces Wound Healing and Reduces Scar Hyperplasia

　　四核苷酸框架核酸（tFNA）通过激活HaCaT细胞自噬（上调ATG5/7，下调LC3I/P62）抑制mTOR通路，促进伤口愈合并减少疤痕增生，动物实验验证了其有效性。

　　创伤往往会导致伤口形成和瘢痕增生，而这一过程可能对患者的健康和生活质量产生深远影响。在伤口愈合过程中，如果细胞无法有效修复受损组织，可能会引发一系列并发症，如慢性伤口、瘢痕过度增生，甚至发展为瘢痕癌等严重问题。因此，探索能够促进伤口愈合并减少瘢痕形成的新型治疗方法具有重要的临床意义。近年来，研究人员发现一种基于DNA结构的新型纳米材料——四面体框架核酸（tFNA）在多种疾病治疗中表现出良好的效果，但其对伤口愈合的具体作用机制尚未完全明确。本研究旨在探讨tFNA对人类永生化表皮细胞（HaCaT细胞）和伤口愈合的影响，通过体外实验与体内实验相结合的方式，揭示其在促进伤口修复和减少瘢痕形成中的作用。

tFNA是一种由四条单链DNA（ssDNA）通过互补碱基配对形成的四面体结构。其稳定的三维构型赋予了它优异的生物相容性和稳定性，使其在临床应用中展现出良好的前景。研究表明，tFNA能够通过多种生物学途径发挥功能，包括促进细胞增殖、迁移，以及在创伤、伤口和炎症性疾病中显示出治疗潜力。近年来，越来越多的证据表明，自噬在伤口愈合和瘢痕形成过程中起着关键作用，而tFNA可能通过激活自噬来影响这一过程。因此，本研究进一步探讨了tFNA在促进自噬、加速伤口愈合及减少瘢痕形成中的具体机制。

在体外实验中，研究人员首先验证了tFNA的结构和物理化学特性。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）确认了tFNA的成功合成，并利用透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）技术检测了其尺寸，结果显示tFNA的直径约为10纳米，且具有负电位（?2.61 mV），这表明其在细胞内具有良好的稳定性。随后，通过免疫荧光染色和流式细胞术检测了tFNA在HaCaT细胞中的摄取情况。结果显示，HaCaT细胞在2小时和12小时后分别有98.50 ± 0.22%和99.61 ± 0.07%的细胞表现出Cy5标记的tFNA，说明其在细胞内具有较高的摄取率。此外，tFNA在HaCaT细胞中的摄取率显著高于其他类型的伤口相关细胞，如人皮肤成纤维细胞（BJ）和人微血管内皮细胞（HMEC），进一步表明其在表皮细胞中的特异性作用。

在评估tFNA的生物相容性时，研究人员采用了多项标准测试，包括细胞毒性、皮肤刺激性、致敏性和热源性检测。结果表明，在100 nM浓度下，tFNA对细胞形态无明显影响，且细胞存活率较高，表明其具有较低的细胞毒性。在皮肤刺激性测试中，实验组的皮肤红肿评分均为零，说明tFNA不会引起明显的皮肤炎症反应。同时，致敏性测试也未发现任何过敏反应，热源性检测显示兔子体温仅有轻微升高，未达到病理学意义上的热源性反应。这些结果表明，tFNA在100 nM浓度下具有良好的生物相容性，符合潜在临床应用的生物安全标准。

接下来，研究人员通过自噬相关实验进一步验证了tFNA对HaCaT细胞自噬的激活作用。TEM观察结果显示，tFNA处理后，HaCaT细胞内的自噬体和自噬溶酶体数量显著增加，尤其是在12小时后更为明显。这表明tFNA能够有效诱导细胞自噬的进行。同时，自噬通量实验也证实了这一现象，通过检测LC3I和LC3II的表达变化，发现LC3I的表达水平下降，LC3II的表达水平上升，LC3I/LC3II的比例降低，这是自噬被激活的典型特征。此外，免疫荧光和Western blot实验还显示，tFNA处理后，自噬相关蛋白ATG5和ATG7的表达水平显著增加，而P62的表达水平下降，进一步支持了tFNA诱导自噬的结论。

在自噬信号通路方面，tFNA的处理显著激活了AMPK，并抑制了mTOR通路，同时促进了ULK1（Ser555）的磷酸化。AMPK是细胞能量代谢的重要调控因子，其激活能够抑制mTOR的活性，从而促进自噬的进行。而ULK1是自噬启动的关键蛋白，其磷酸化程度的增加意味着自噬被有效激活。此外，通过基因敲除实验，研究人员进一步验证了tFNA诱导自噬的机制。当ATG5和ATG7基因被敲除后，tFNA对自噬的诱导作用被显著削弱，这说明这两个基因在tFNA诱导自噬过程中起着关键作用。同时，tFNA对细胞增殖和迁移的影响也被验证，结果显示其在100 nM浓度下能够显著促进HaCaT细胞的增殖和迁移，而这一作用与自噬的激活密切相关。

在体内实验中，研究人员采用了Bama微型猪和新西兰白兔作为模型，进一步评估tFNA对伤口愈合和瘢痕形成的影响。在Bama微型猪的实验中，研究人员在背部制造了全层皮肤缺损，并在不同浓度下注射tFNA。结果显示，100 nM浓度的tFNA能够显著提高伤口愈合率，并缩短愈合时间。同时，通过Vancouver瘢痕评分（VSS）评估瘢痕情况，发现tFNA处理组的瘢痕评分显著低于对照组，表明其具有减少瘢痕形成的潜力。此外，Sirius红-苦味酸染色（SR-PA）结果显示，tFNA处理组的I型胶原沉积减少，III型胶原增加，胶原排列更加有序，进一步支持了其在减少瘢痕形成方面的积极作用。

在新西兰白兔的实验中，研究人员通过耳部瘢痕模型验证了tFNA对瘢痕形成的影响。实验组在瘢痕形成后第7天和第90天分别进行了瘢痕评分，结果显示tFNA能够有效预防病理性的瘢痕增生，且在长期观察中，其瘢痕形成效果更加显著。HE染色进一步揭示了tFNA处理组的瘢痕组织结构更加接近正常皮肤，说明其可能促进了一种更接近再生修复的愈合模式。此外，免疫荧光结果显示，tFNA处理组的CD31阳性细胞数量增加，表明其可能通过促进血管新生来加速伤口愈合。

尽管tFNA在伤口修复和瘢痕预防方面表现出良好的效果，但本研究仍存在一定的局限性。首先，实验主要集中在急性伤口模型上，对于慢性伤口的治疗效果尚未进行深入研究。慢性伤口的形成往往与复杂的病理机制有关，因此需要进一步探讨tFNA在慢性伤口中的作用。其次，虽然tFNA在促进自噬方面表现出显著效果，但其对角质形成细胞（keratinocytes）的特异性作用尚未得到充分验证。角质形成细胞是表皮修复的关键细胞类型，因此未来的研究应进一步探讨tFNA在这些细胞中的作用机制。此外，虽然tFNA能够促进伤口愈合，但其具体的分子机制仍需进一步阐明，以便为其临床应用提供更坚实的理论基础。

总的来说，本研究通过体外和体内实验，系统地揭示了tFNA在促进伤口愈合和减少瘢痕形成中的作用机制。tFNA通过激活自噬，抑制mTOR通路，促进AMPK和ULK1的活性，从而增强细胞的修复能力。其在HaCaT细胞中的作用表现为促进细胞增殖和迁移，加速伤口愈合，同时减少胶原沉积和瘢痕形成。这些结果不仅为tFNA在伤口治疗中的应用提供了科学依据，也为未来开发更高效的瘢痕预防策略提供了新的思路。随着对tFNA作用机制的进一步研究，有望将其应用于更广泛的临床场景，为改善患者的生活质量和减轻瘢痕相关疾病带来的负担提供新的解决方案。