PACLseq：一种基于纳米孔测序技术的Ph样急性淋巴细胞白血病的独立诊断方法

《MedComm》：PACLseq: A Standalone Diagnostic Method for Ph-Like Acute Lymphoblastic Leukemia Using Nanopore Sequencing

　　检测特发性 Philadelphia 染色体样急性淋巴细胞白血病（Ph-like ALL）相关融合基因的创新方法 PACLseq，基于纳米孔测序技术设计靶向检测面板，包含 ABL2、CSF1R、PDGFRB、JAK2、ABL1、EPOR 和 CRLF2 等基因。在47例临床样本中验证，93.3%灵敏度和100%特异性，尤其适用于降解RNA样本（RIN >3）和低质量样本（RIN ≤3），检测时间缩短至3天，成本降低50%。成功识别新型融合基因ZBTB5::JAK2，为临床快速诊断和靶向治疗提供高效解决方案。

　　在临床诊断中，Philadelphia chromosome–like acute lymphoblastic leukemia（Ph-like ALL）是一种重要的白血病亚型，其诊断和治疗方案的选择高度依赖于对相关融合基因的准确检测。Ph-like ALL的特征在于缺乏典型的Philadelphia染色体（即BCR::ABL1融合），但其基因表达谱与Ph+ ALL（携带BCR::ABL1融合的急性淋巴细胞白血病）非常相似。这种疾病在儿童中约占10%–20%，在成人中约占20%–30%，并且与较高的复发率和较差的预后密切相关。因此，对于Ph-like ALL的早期诊断和及时干预至关重要。然而，目前的诊断方法在效率、成本和对降解样本的适应性方面存在明显局限。传统的诊断流程通常需要7–14天的时间才能完成，且成本较高，难以在临床实践中广泛应用。

为了解决这些挑战，研究人员开发了一种新的诊断方法，称为Partial Anchored Capture and Long-Read Sequencing（PACLseq），该方法基于纳米孔测序技术。PACLseq的核心在于通过特定的探针设计，对一组与Ph-like ALL相关的融合基因进行靶向捕获，并结合长读长测序技术，以提高融合基因的检测精度和效率。这些靶向基因包括ABL2、CSF1R、PDGFRB、JAK2、ABL1、EPOR和CRLF2，这些基因的融合事件在Ph-like ALL中较为常见。通过这一方法，研究人员能够在较短时间内完成对这些融合基因的检测，并且即使在RNA质量较差的样本中也能保持较高的灵敏度和特异性。

在方法建立过程中，研究人员首先对多个样本进行了验证，包括标准样本和临床样本。通过比较不同的实验条件和探针设计，他们发现PACLseq在检测融合基因方面具有显著优势。例如，使用10 ng的RNA输入量，就能有效检测到融合基因，这比传统方法所需的样本量大大减少。此外，PACLseq的检测时间仅需3天，远低于传统方法所需的7–14天，同时还能显著降低检测成本，达到50%的降幅。这种快速、低成本、高灵敏度的检测手段，为Ph-like ALL的临床诊断提供了全新的解决方案。

在实验过程中，研究人员还对不同类型的样本进行了盲法测试，以验证PACLseq在实际应用中的可靠性。测试包括来自骨髓和外周血的样本，其中一些样本的RNA完整性指数（RIN）较低，表明其RNA降解程度较高。尽管如此，PACLseq在这些样本中依然表现出良好的检测能力，尤其是在RIN > 3的样本中，其灵敏度达到93.33%，特异性为100%。而在RIN ≤ 3的样本中，PACLseq依然能够检测到71.45%的融合事件，尽管存在一定的假阴性情况，但这些可能是由于融合频率极低或样本质量严重下降所致。这种结果表明，PACLseq在处理降解样本方面具有良好的耐受性，为临床环境中样本质量不稳定的患者提供了新的检测手段。

值得注意的是，PACLseq还成功检测到了一些新型融合基因，如ZBTB5::JAK2。这种融合基因的发现不仅有助于更全面地理解Ph-like ALL的分子机制，也为未来的诊断和治疗策略提供了新的依据。然而，由于某些融合基因的结构复杂，如涉及非编码区域的融合（如IGH::CRLF2、IGK::EPOR等），PACLseq可能无法完全检测到这些情况。因此，对于这类融合事件，可能需要进一步优化检测流程，或者结合其他技术手段，如全基因组测序，以提高检测的全面性。

PACLseq的技术优势在于其对长读长测序平台的利用，以及对特定基因区域的靶向捕获。这种方法不仅提高了融合基因的检测效率，还能够在单一实验中同时分析多个样本，从而降低了成本。此外，PACLseq的检测流程相对简便，不需要复杂的样本预处理步骤，也不需要大量的计算资源，这使其在资源有限的临床环境中更具实用性。这种技术的引入，为Ph-like ALL的诊断和治疗决策提供了新的可能性，有助于提高患者的生存率和治疗效果。

总体而言，PACLseq作为一种新型的融合基因检测方法，展现了其在临床应用中的巨大潜力。它不仅能够在短时间内提供准确的检测结果，还能适应多种样本类型，包括降解严重的样本。这种方法的开发，为Ph-like ALL的诊断流程带来了重要的改进，有助于实现更早、更精准的疾病干预。未来，研究人员计划进一步优化该方法，扩大其检测范围，并探索其在其他相关疾病中的应用。同时，他们也希望通过大规模的临床研究，验证PACLseq在实际诊断中的可靠性，并推动其在更多医疗机构中的使用。