泛癌种循环肿瘤DNA检测作为一线诊断工具的验证与临床效用研究

　　本研究针对ctDNA检测在泛癌种一线应用中的可行性与临床效用问题，开发并验证了一种33基因NGS panel（MCLBP）。结果显示：检测失败率为0%，在65.0%患者中检出具有临床指导意义变异（Tier I/II），与组织检测相比灵敏度达76%，且平均提前21天出具结果。该研究为ctDNA作为组织不可及时的替代检测方案提供了有力证据，尤其对胆管癌等取材困难癌种具有重要临床价值。

　　

在精准医疗时代，肿瘤的分子 profiling（分析）已成为指导治疗决策的核心环节。传统上，组织活检（tissue biopsy）被视为获取肿瘤基因组信息的金标准，但其存在明显局限性：侵入性操作带来风险和痛苦、肿瘤解剖位置难以触及、样本量不足无法进行分子分析，以及单次活检仅能反映特定时空点的肿瘤特性，无法捕捉肿瘤异质性（tumor heterogeneity）。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）检测作为一种非侵入性的液体活检（liquid biopsy）技术，通过检测血液中肿瘤释放的DNA碎片，为克服这些挑战提供了新思路。然而，ctDNA在细胞游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）中占比极低，检测灵敏度受限，其在泛癌种（pan-cancer）设置中作为一线检测手段的可行性及临床效用尚未明确。

为了回答这些问题，Mayo Clinic的研究团队开展了一项研究，验证了其自主研发的33基因下一代测序（next-generation sequencing, NGS）panel——Mayo Complete Liquid Biopsy Panel（MCLBP），并利用真实世界临床数据评估了该检测的临床应用价值。相关研究成果发表在《The Journal of Molecular Diagnostics》上。

研究团队采用了几项关键技术方法：首先，他们利用临床血浆样本、健康 donor（供体）血浆及商业参考品（如 SeraCare、Horizon 和 OncoSpan 的 ctDNA 参考材料）进行 analytical validation（分析验证）；其次，使用 MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit 从血浆中提取 cfDNA，并基于杂交捕获（hybrid capture）技术和 Illumina NextSeq 550 平台进行高通量测序，平均测序深度达 30,000X；第三，应用 PGDx Elio Plasma Resolve 生物信息学流程（v6.2.1.1）检测单核苷酸变异（SNVs）、插入缺失（delins）、拷贝数变异（CNVs）、基因融合（fusions）和微卫星不稳定性（MSI）状态；最后，使用 Association for Molecular Pathology/American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists（AMP/ASCO/CAP）指南对检测到的变异进行临床意义分级（Tier I-III）。临床队列包括123例接受一线ctDNA检测的患者和48例有 matched（匹配）组织样本的患者。

MCLBP验证

通过 analytical validation，研究团队证明MCLBP具有高度的精确性和可重复性：SNVs和delins变异在0.5% VAF（variant allele fraction，变异等位基因频率）下的灵敏度为100%，扩增（amplifications）和融合的灵敏度分别为95.2%和100%。特异性（specificity）达100%。检测在 MSI（微卫星不稳定性）状态判定中也表现良好，但在子宫内膜癌中灵敏度较低，这与该癌种中微卫星变化较细微的特性有关。

MCLBP作为临床泛癌种ctDNA检测

在123例患者中，肺癌（39.0%）、结肠癌（13.8%）和胆管癌（8.9%）是最常见的癌种。80.5%的患者为晚期（IV期）。进行ctDNA检测的主要原因是组织不足或无法获取（69.1%）。检测失败率为0%，平均 turnaround time（报告时间）为10天，较组织测序（31天）显著缩短。

临床可行性与可行动性

65.0%的患者检出具有临床可行动性（actionable）的变异（Tier I或II），其中33.3%为Tier I变异。肺癌和结肠癌的 actionable 变异检出率最高（分别为72.9%和70.6%）。值得注意的是，54.5%的胆管癌患者检出Tier I或II变异，突显了ctDNA检测在组织取材困难癌种中的价值。检测到的180个可行动变异中，46.7%为靶向治疗敏感变异（如EGFR、PIK3CA），16.7%为耐药变异（如KRAS、NRAS）。此外，研究还发现了融合基因（如RET、NTRK1），这些变异在胆管癌中尤其重要。

临床灵敏度

在48例匹配组织检测的患者中，ctDNA对组织Tier I变异的灵敏度（sensitivity）为76%，对Tier I/II变异为75%。同时进行ctDNA和组织检测可使可行动变异检出数增加14.3%。部分变异仅见于ctDNA（如PIK3CA、KRAS、NRAS），可能代表肿瘤异质性或亚克隆群体；而一些组织独有变异（如EGFR、TP53）可能因ctDNA含量低而未被捕获。

研究结论与讨论部分强调，尽管ctDNA在cfDNA中占比极低（可能低至0.1%），但通过优化检测 panel（聚焦33个临床可行动基因）和生物信息学分析，MCLBP在真实世界临床环境中展现出高可行性（>99%成功率）、高可行动性（65%患者检出临床显著变异）和高临床灵敏度（75%）。该检测尤其适用于组织不可及的晚期肿瘤患者（如胆管癌）以及需要快速 turnaround time 的场景。同时，研究也指出了一些局限性：缺乏 matched 白细胞测序可能增加克隆造血（clonal hematopoiesis, CHIP）相关假阳性风险；子宫内膜癌中MSI检测灵敏度较低；样本量有限阻碍了癌种特异性分析的深入。未来需要通过更大规模的前瞻性研究来进一步优化ctDNA检测策略，并推动其整合进临床实践路径。

综上所述，这项研究为ctDNA作为泛癌种一线基因组检测工具提供了扎实的验证数据和临床证据，奠定了其在肿瘤精准医疗中的重要地位。