转录组规模CRISPR-Cas13筛选揭示生存必需长链非编码RNA的功能图谱

《Advanced Biotechnology》：Uncovering essential lncRNAs through transcriptome-scale CRISPR-Cas13 screening

　　语 为解决长链非编码RNA（lncRNA）功能研究面临的低丰度、结构复杂及传统DNA靶向技术脱靶效应强等难题，Neville E. Sanjana团队开发了CaRPool-seq（Cas13 RNA Perturb-seq）平台，通过转录组规模CRISPR-Cas13筛选，在5种人类细胞系中鉴定出778个生存必需lncRNA（其中46个为普适必需），并揭示其通过p53、E2F等通路调控细胞周期与凋亡的机制。该研究为lncRNA功能解析提供了高精度RNA靶向工具，推动其在癌症生物标志物与精准医疗中的应用。

　　

在人类基因组中，约75%的DNA序列能够转录为RNA，但其中仅有不到5%编码蛋白质，绝大多数转录产物为非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）。这类分子虽不参与蛋白质合成，却在细胞分化、疾病发生等生命过程中扮演关键调控角色。尤其长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）作为ncRNA的主要类别，长度超过200个核苷酸，占ncRNA总量的80%-90%，其表达具有高度组织特异性和疾病关联性，被视为潜在疾病标志物和治疗靶点。然而，lncRNA的低序列保守性、表达丰度有限及复杂二级结构，导致其功能研究长期面临技术瓶颈。

传统RNA干扰（RNAi）和CRISPR-Cas9技术虽能部分揭示lncRNA功能，但存在效率低、脱靶风险高、难以规模化等问题。例如，CRISPR-Cas9需通过双sgRNA（guide RNA）删除基因组片段才能完全敲除lncRNA，易误伤相邻蛋白编码基因（protein-coding genes, PCGs）。为突破这些局限，Neville E. Sanjana团队在《Advanced Biotechnology》发表研究，首次利用CRISPR-Cas13系统开发了转录组规模筛选平台CaRPool-seq，直接靶向RNA实现高效、特异的lncRNA功能解析。

关键技术方法

研究团队基于人类从胚胎早期（孕4周）至成年期26个发育阶段的lncRNA表达数据，构建包含75,000条gRNA的文库，靶向6,199个lncRNA和4,399个PCGs。通过慢病毒将文库导入HAP1、HEK293T、K562、MDA-MB-231和THP1五种人类细胞系，进行功能性筛选。采用单细胞转录组分析（single-cell transcriptomics）与基因集富集分析（GSEA）解析lncRNA调控网络，并整合约9,000例肿瘤转录组数据评估其临床相关性。

研究结果

1. 大规模筛选鉴定生存必需lncRNA

通过检测gRNA在培养第0、7、14天的丰度变化，发现靶向必需lncRNA的gRNA因细胞生存压力显著减少。共筛选出778个在至少一种细胞系中必需的lncRNA，其中46个（如MALAT1、MIR17HG）在所有五种细胞系中普适必需。这些lncRNA表达水平较高，功能保守，且多呈反义或双向转录结构，而非基因间孤立转录本。

2. 必需lncRNA的独特功能特征

与必需PCGs相比，必需lncRNA在较低表达水平即可发挥功能，且多数不与其相邻PCGs共表达，表明其作用具有独立性。通过单细胞转录组分析发现，敲低必需lncRNA会阻碍细胞周期进程并诱导凋亡，富集通路包括p53、E2F、G2M检查点、MYC和mTOR等关键增殖信号轴。

3. 发育与疾病背景下的动态表达

必需lncRNA在胚胎早期高表达，随发育进程下调，在脑、心、肝、肾等增殖活跃组织中富集。肿瘤数据分析显示，其在癌细胞中表达变异度显著高于非必需lncRNA，且与致癌驱动基因共表达，提示其参与肿瘤异质性调控，并与患者生存率相关。

结论与意义

该研究建立了CRISPR-Cas13作为lncRNA功能研究的精准化、规模化平台，不仅揭示lncRNA在细胞生存中的核心地位，还凸显其作为癌症等疾病靶标的潜力。未来需结合人工智能优化gRNA设计、扩展转录组覆盖度，并在疾病模型中验证临床转化价值。这一技术范式可延伸至microRNA、环状RNA等其他ncRNA研究，为精准医疗提供新工具。