CAP1基因启动子甲基化上调通过Bax/Bcl-2/Caspase-3通路促进肺腺癌细胞凋亡并抑制迁移侵袭的机制研究

　　本研究针对肺腺癌（LUAD）中CAP1基因异常高表达的问题，通过CRISPR-dCas9-Dnmt3a表观遗传编辑技术特异性上调CAP1启动子甲基化水平，发现其能显著抑制LUAD细胞增殖、迁移和侵袭能力，并促进细胞凋亡。机制研究表明该效应通过Bax/Bcl-2/Caspase-3凋亡通路和Cofilin/Actin细胞骨架重构通路实现，同时证实CAP1启动子甲基化受Dnmt3a和Tet1/2共同调控。该研究为肺腺癌靶向治疗提供了新的表观遗传干预策略。

　　

肺腺癌作为肺癌最常见的组织学亚型，是全球癌症相关死亡的首要原因，五年生存率不足20%。其发生发展与遗传和环境因素密切相关，而DNA甲基化异常作为肿瘤早期的重要表观遗传标志，在肺腺癌发病机制中扮演关键角色。腺苷酸环化酶相关蛋白1（CAP1）是一种在多种恶性肿瘤中高表达的功能蛋白，与肿瘤进展呈正相关，但其在肺腺癌中的表达调控机制及功能尚未完全阐明。

研究人员通过临床样本分析发现，早期肺腺癌组织中CAP1蛋白表达显著高于癌旁正常组织，且在A549、H1299和PC9等肺腺癌细胞系中同样呈现高表达特征。进一步研究揭示CAP1启动子存在两个CpG岛，在肺腺癌细胞和组织中呈现异常低甲基化状态。为探究甲基化调控CAP1表达的功能意义，研究团队创新性地构建了pdCas9-Dnmt3a-BSD质粒系统，通过CRISPR-dCas9-Dnmt3a表观遗传编辑技术特异性上调CAP1启动子甲基化水平，成功建立了稳定转染的H1299-dCas9-sg-CAP1和A549-dCas9-sg-CAP1细胞株。

关键技术方法包括：利用CRISPR-dCas9-Dnmt3a系统进行靶向DNA甲基化编辑；MassARRAY甲基化测序分析CpG位点甲基化状态；临床样本来自宁波市第二医院6对肺腺癌/癌旁组织；通过CCK-8、克隆形成、流式细胞术、伤口愈合和Transwell实验评估细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力；Western blot和qPCR分析相关分子表达。

研究结果方面：

CAP1基因在核酸水平高表达且其启动子在LUAD细胞中异常低甲基化

通过PCR和qPCR检测发现CAP1在肺腺癌细胞系中表达显著高于正常肺上皮细胞Beas-2B（P<0.05）。MassARRAY甲基化测序显示CAP1启动子CpG岛-1中多个CpG位点（第5、11、12、14、15、19和22位）在H1299细胞中的甲基化程度低于Beas-2B细胞（P<0.05）。

CAP1蛋白在早期LUAD组织中高表达且其启动子异常低甲基化

免疫组化分析显示癌组织中CAP1蛋白呈强或中等阳性，而癌旁组织呈弱阳性（P<0.05）。MassARRAY检测发现癌组织中CpG岛-1的9个CpG位点（第1、14、15、18、19、22、24、25和31位）甲基化水平显著低于癌旁组织（P<0.05）。

构建稳定转染的LUAD细胞株上调CAP1启动子甲基化

成功构建能特异性上调CAP1启动子甲基化的H1299-dCas9-sg-CAP1和A549-dCas9-sg-CAP1细胞株，Western blot证实这些细胞中CAP1蛋白表达显著降低（P<0.05）。MassARRAY显示CpG岛-1中第1、18、19和22位CpG位点甲基化水平显著上调。

上调CAP1启动子甲基化对LUAD细胞生物学特性的影响

CCK-8和克隆形成实验表明上调甲基化显著抑制细胞增殖（P<0.05）。流式细胞术显示细胞总凋亡率显著增加（P<0.05）。伤口愈合实验显示细胞迁移距离显著减少（P<0.01）。Transwell实验表明细胞迁移和侵袭数量显著降低（P<0.01）。

CAP1甲基化影响LUAD细胞凋亡的机制

Western blot分析显示上调甲基化后Bax/Bcl-2比值和Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值显著增加（P<0.05），表明通过Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路促进凋亡。

CAP1甲基化影响LUAD细胞迁移和侵袭的机制

上调甲基化后CAP1、Cofilin和总Actin蛋白表达均显著降低（P<0.05），表明通过细胞骨架重构通路抑制迁移侵袭。

CAP1甲基化的调控因素

TCGA数据库分析显示Dnmt3a和Tet1在肿瘤组织中高表达（P<0.001）。Decitabine（Dnmts抑制剂）处理可上调CAP1表达，而Bobcat339（Tet1/2抑制剂）处理可下调CAP1表达并抑制细胞增殖。

研究结论表明，CAP1启动子在肺腺癌中存在异常低甲基化，导致其高表达。通过CRISPR-dCas9-Dnmt3a系统特异性上调CAP1启动子甲基化，可显著抑制肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡，这些效应通过Bax/Bcl-2/Caspase-3凋亡通路和Cofilin/Actin细胞骨架重构通路实现。同时发现CAP1启动子甲基化受Dnmt3a和Tet1/2共同调控。该研究不仅揭示了CAP1在肺腺癌中的表观遗传调控机制，更为肺腺癌的靶向治疗提供了新的策略，特别是通过表观遗传编辑技术特异性调控基因甲基化水平可能成为肺癌治疗的新方向。研究成果发表于《European Journal of Medical Research》，为临床开发针对早期肺腺癌的表观遗传治疗方法提供了重要的实验依据和理论支撑。