基于牛乳酪蛋白理性设计的抗菌肽NCP1：抗真菌机制与生物活性评价

　　本研究针对日益严重的抗菌药物耐药性（AMR）问题，通过机器学习和理性设计策略从牛乳酪蛋白中开发出一种新型抗菌肽NCP1。该肽对白色念珠菌（Candida albicans）表现出快速杀灭作用（MFC=250μg/mL），能有效抑制生物膜形成、结合麦角固醇并破坏真菌细胞壁，同时具有低细胞毒性和溶血活性。这项工作为开发基于天然蛋白来源的抗真菌治疗剂提供了新思路。

　　

随着抗生素的过度使用，全球正面临日益严峻的抗菌药物耐药性（AMR）危机。据预测，2025至2050年间耐药性感染可能导致约1.69亿人死亡。传统抗生素开发陷入停滞，过去20年未有新类别抗生素问世，这使得寻找新型抗菌策略变得尤为紧迫。

在众多替代方案中，抗菌肽（AMPs）因其广谱活性、低耐药性风险和多重作用机制而备受关注。这些天然存在于生物体内的肽类物质能够靶向微生物膜结构，并与细胞壁、DNA和蛋白质等多种细胞组分相互作用。特别是牛奶来源的生物活性肽，如酪蛋白衍生肽，不仅具有营养功能，还展现出显著的生理调节活性，包括免疫增强、血压调节和潜在的抗癌作用。

在这项发表于《Amino Acids》的研究中，伊朗研究团队采用计算生物学与实验验证相结合的策略，从牛乳酪蛋白中理性设计并合成了一种新型抗菌肽NCP1，并系统评价了其生物学特性。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过CAMPR4服务器的机器学习算法（SVM、RF、ANN）进行抗菌肽预测和理性设计；固相合成法合成肽段并经HPLC纯化和质谱验证；圆二色谱（CD）分析二级结构；微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）；时间杀灭动力学实验；棋盘法评估协同效应；结晶紫染色法检测生物膜抑制；电泳迁移率变动分析（EMSA）检测DNA结合活性；麦角固醇和几丁质结合实验；分子对接模拟；MTT法检测细胞毒性；溶血实验；场发射扫描电镜（FE-SEM）观察形态学变化。

肽设计及理化性质预测

通过分析牛酪蛋白序列（αS1、αS2、β、κ-casein），利用多种算法预测出具有抗菌潜力的10氨基酸肽段。经过四轮理性设计，最终选择序列FFSLKILKKK（命名为NCP1）。生物信息学分析表明该肽具有两亲性α-螺旋结构，无毒性、无过敏原性，与人类蛋白无同源性。

抗菌活性评估

NCP1表现出显著的选择性抗真菌活性，对白色念珠菌和克柔念珠菌的MIC为125μg/mL，对光滑念珠菌的MIC为500μg/mL。而对细菌（金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）及黑曲霉的活性较弱（MIC>500μg/mL）。

杀灭动力学

NCP1在4小时内完全杀灭白色念珠菌，速度显著快于氟康唑，后者在整个24小时观察期内未能实现完全灭菌。

协同效应分析

NCP1与氟康唑或制霉菌素联合使用时未表现出协同效应（FIC>1），可能与它们共享麦角固醇靶点有关。

生物膜抑制能力

NCP1在较高浓度（125-500μg/mL）下对白色念珠菌生物膜形成抑制率超过90%，且在低浓度（0.48μg/mL）下仍保持约32%的抑制率，表现出独特的剂量非依赖性特征。

作用机制研究

EMSA实验显示NCP1能与DNA结合；麦角固醇结合实验表明其MIC在麦角固醇存在时从125μg/mL升高至500μg/mL，证实了其通过结合麦角固醇破坏真菌细胞膜的机制；分子对接显示NCP1与麦角固醇具有较高的结合亲和力（结合能-7.1kcal/mol）；FE-SEM观察证实NCP1处理导致真菌细胞表面出现皱褶、孔洞形成、核酸泄漏和最终细胞裂解。

安全性评价

MTT实验表明NCP1对L929小鼠成纤维细胞的IC₅₀值为1811μg/mL，远高于其MIC值（125μg/mL），在500μg/mL浓度下细胞存活率仍接近80%。溶血实验显示即使在最高测试浓度（500μg/mL）下，溶血率也低于2.5%，表明其具有良好的生物相容性。

稳定性挑战

NCP1的抗菌活性在含盐环境（150mM NaCl和1mM MgCl₂）中显著降低，表明其对抗离子条件的敏感性可能限制其临床应用。

本研究成功从牛乳酪蛋白中开发出一种具有选择性强效抗真菌活性的抗菌肽NCP1。该肽通过多重机制发挥作用，包括结合麦角固醇破坏细胞膜完整性、与DNA相互作用以及抑制生物膜形成。其快速杀灭真菌的能力、低细胞毒性和溶血活性使其成为对抗真菌感染的有前景候选分子。然而，其在盐环境中的稳定性问题仍需进一步优化。这项工作不仅为抗真菌药物开发提供了新思路，也展示了从天然食物蛋白中挖掘生物活性肽的巨大潜力，为应对抗菌耐药性挑战提供了新的解决方案。