利用高通量行为表型分析揭示25种秀丽隐杆线虫疾病模型的多维表型特征及其机制研究

　　本研究针对遗传诊断快速发展背景下疾病相关变异功能验证的挑战，利用自动化多维行为追踪技术系统评估了25种秀丽隐杆线虫疾病模型（包括纯合缺失和患者特异性点突变）的行为表型。研究发现BORC复合体突变导致显著运动异常，folliculin通路突变通过AMPK/mTOR信号影响代谢表型，而SMC-3点突变虽不影响胚胎存活但引起发育和行为缺陷。该研究建立了可扩展的表型分析平台，为罕见病机制研究和药物重定位提供了重要技术支撑。

　　

随着基因测序技术的飞速发展，遗传诊断正变得愈发快速和经济，但这也带来了新的挑战：我们如何快速评估新发现的疾病致病变异的功能影响？如何为数千种罕见遗传病寻找潜在治疗方法？目前约95%的罕见病缺乏批准的治疗方案或经过验证的治疗靶点，其中约74%的罕见病影响中枢神经系统，导致临床表型复杂多样。更复杂的是，同一基因内的不同变异可能导致完全不同的表型特征。在这种背景下，开发高效研究患者特异性突变的方法，对于支持个性化治疗的发展至关重要。

模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）为系统建模遗传疾病提供了可能性，但长期以来缺乏稳健的高通量分析方法。发表在《BMC Biology》的这项研究通过自动化多维行为追踪技术，成功检测到25种新创建的线虫疾病模型中的表型特征，涵盖了从纯合功能缺失突变到患者特异性单氨基酸替换的多种变异类型。

研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了25种线虫疾病模型（包括纯合缺失突变和患者特异性点突变）；其次采用自动化多维行为追踪平台，通过96孔板成像系统记录线虫在刺激前、蓝光刺激和刺激后三个阶段的运动行为；使用Tierpsy软件提取了8,289个行为特征参数进行量化分析；最后通过化学敏感剂（如aldicarb、paraquat）和温度处理等条件优化来增强弱表型模型的检测灵敏度。所有线虫样本均采用标准化的培养和同步化流程制备。

BORC复合体突变

研究人员发现BORC（BLOC-one-related complex）复合体相关基因（blos-1、blos-8、blos-9和sam-4）的纯合缺失突变体均表现出强烈的行为表型，与野生型相比有超过3,000个显著差异特征。其中blos-1(syb6895)、blos-9(syb7029)和sam-4(syb6765)突变体体型较短，而blos-8(syb6686)则较长。这些突变主要影响头部相关特征，包括角速度降低、曲率变化和加速度改变。特别值得注意的是，blos-9缺失破坏了ARL-8/UNC-104 anterograde运输通路，可能减少了突触小泡的递送和神经传递，从而削弱了对刺激的运动反应。

Folliculin突变

在Birt-Hogg-Dubé综合征相关基因研究中，flcn-1（FLCN ortholog）和fnip-2（FNIP1和FNIP2 ortholog）的纯合缺失突变体均存活且无发育延迟，但表现出强烈的行为表型（分别有3,663和3,433个显著差异特征）。flcn-1(syb8071)突变体比野生型更长但宽度无差异，而fnip-2(syb8038)突变体则更短更宽。两种突变体均表现出所有身体 segments角速度增加和曲率时间导数升高。研究人员进一步使用AMPK/mTOR通路调节化合物处理这些突变体，发现BI-9774（pan-AMPK activator）处理显著降低了野生型和fnip-2突变体的运动速度，而BAY-3827（选择性AMPK抑制剂）处理则引起所有菌株大多数速度相关特征的强烈增加。

增强TNPO2患者avatar在表型空间中的分离

对于表型较弱的imb-2[D157N]（TNPO2 ortholog）突变体，研究人员尝试了多种敏感化策略。虽然RNAi敲低imb-1或imb-3基因以及温度处理效果有限，但化学perturbation取得了显著效果。使用paraguat（1 mM处理4小时）导致imb-2(syb6372)和野生型之间出现1,907个显著行为差异，主要涉及速度相关特征。更令人印象深刻的是，aldicarb处理显示出了剂量依赖性的 paralysis效果：1 mM aldicarb处理4小时后，野生型几乎完全瘫痪，而imb-2[D157N]突变体仍保持运动能力，表明其突触传递水平降低，乙酰胆碱在突触间隙积累较慢。

粘连蛋白亚基SMC-3的突变

研究人员还研究了一个在Cornelia de Lange综合征（CdLS）患者中发现的SMC3[K114E]变异（在线虫中对应为SMC-3[K115E]）。虽然纯合缺失粘连蛋白功能在线虫中通常是致死的，但SMC-3[K115E]纯合突变体在 brood size和胚胎存活率方面与野生型无显著差异。然而，确实有一小部分后代出现发育缺陷，包括幼虫停滞、 vulva突出和体形异常。行为追踪显示成年纯合突变体有5,685个显著行为差异，表现为体型更长、中体曲率增加但头部曲率和角速度降低。这些发现表明SMC-3[K115E]替代在不影响胚胎存活的情况下贡献了发育和行为缺陷，模拟了CdLS患者的表型特征。

该研究通过高通量行为表型分析成功建立了25种线虫疾病模型的功能特征图谱，证明这种可扩展的表型分析方法能够捕获从强到弱的各种突变效应。研究发现BORC复合体突变导致显著的溶酶体定位和运动功能异常，folliculin通路突变通过AMPK/mTOR信号影响代谢表型，而化学敏感化策略能够增强弱表型模型的检测灵敏度。这些发现为系统性地创建、表型分析和筛选患者特异性遗传变异奠定了基础，可能促进以疾病基因发现相称的速度发现先导化合物和开发个性化治疗方法。

研究的重要意义在于建立了一个标准化、可扩展的平台，能够快速评估疾病相关基因变异的功能影响，特别是对于那些功能未知或研究较少的基因。该方法不仅适用于功能缺失突变，也能有效评估患者特异性点突变的表型效应。通过化学和遗传敏感化策略，即使是表型较弱的突变体也能用于药物筛选，极大扩展了罕见病研究的工具包。随着更多疾病基因的发现，这种系统性的方法有望加速罕见病治疗药物的发现和开发进程。