光响应性纳米PROTAC通过代谢重编程增强焦亡介导的免疫治疗：三阴性乳腺癌治疗新策略

　　本研究针对光动力疗法(PDT)在肿瘤高糖代谢和缺氧微环境(TME)中的局限性，开发了一种酶响应型纳米PROTAC（NanoTAC）系统。该系统通过降解HK2蛋白抑制糖酵解和线粒体呼吸，逆转TME缺氧状态，显著增强PDT诱导的焦亡效应，并激活抗肿瘤免疫应答。在TNBC模型中实现了60%的完全缓解率，且有效抑制转移和复发，为代谢干预联合光免疫治疗提供了创新策略。

　　

肿瘤微环境（TME）的缺氧和高糖代谢特性严重限制了光动力疗法（PDT）的疗效，同时阻碍了抗肿瘤免疫应答。PDT虽能诱导焦亡（pyroptosis）这种具有免疫原性的细胞死亡方式，但缺氧导致活性氧（ROS）生成不足，而肿瘤细胞依赖的Warburg代谢又进一步消耗氧气并产生免疫抑制性代谢物。此外，传统纳米载体存在载药量低、稳定性差和潜在毒性等问题。为解决这些难题，研究人员开发了一种新型光响应性纳米PROTAC（NanoTAC），通过超分子自组装实现无载体纳米化，兼具靶向蛋白降解和光动力治疗功能。

本研究主要采用以下关键技术：

1. 1.
   酶响应型纳米PROTAC的合成与自组装技术（基于cathepsin B可裂解 linker连接HK2靶向PROTAC与光敏剂verteporfin）
2. 2.
   分子动力学模拟与溶剂可及性分析（CHARMM力场与GROMACS软件）
3. 3.
   体外肿瘤模型评估（4T1三阴性乳腺癌细胞系，含缺氧模型）
4. 4.
   体内正交肿瘤模型（BALB/c小鼠原位TNBC模型）
5. 5.
   免疫细胞分析（流式细胞术检测DC成熟、CTL活化及细胞因子分泌）
6. 6.
   蛋白降解机制研究（Western blot分析HK2降解途径）
7. 7.
   实时生物发光/荧光成像（IVIS系统监测肿瘤靶向与肺转移）

Design, preparation, and characterization

通过分子动力学模拟证实药物偶联物通过烷基-烷基、π-π堆积等疏水作用自发组装成73.58 nm的纳米颗粒，在血清中保持4天稳定性。紫外光谱显示其保留verteporfin特征吸收峰，ROS量子产率达0.78。Cathepsin B特异性激活实验表明仅在肿瘤生物标志物存在时发生裂解，释放活性PROTAC（对HK2和VHL的KD值分别为3.48 nM和5.29 nM）。

In vitro glycolysis inhibition and photodynamic activity

NanoTAC在4T1细胞中呈时间依赖性积累，12小时达峰值。通过蛋白酶体依赖的途径降解HK2，抑制糖酵解（乳酸产量下降）和线粒体呼吸（氧消耗减少）。在缺氧条件下，NanoTAC(+L)组的ROS生成仅下降36.1%，显著优于VPF(+L)组的79.1%下降率，证明代谢重编程有效改善PDT效率。

Enhanced pyroptosis to increase antitumor immunity

激光照射后NanoTAC处理组显示c-CASP3和GSDME-NT片段上调，伴随细胞膜气泡状形态变化。JC-1染色证实线粒体膜电位下降。DAMPs（CRT、HMGB1、HSP70）释放显著增加，促炎因子IL-18、IL-1β、TNF-α、IFN-γ分泌升高，而IL-10下降。共培养实验显示成熟DC（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）和CTL（CD45⁺CD3⁺CD8⁺）比例显著增加。

Biodistribution and antitumor efficacy in an orthotopic TNBC mouse model

体内分布显示NanoTAC通过EPR效应在肿瘤区域富集，蓄积量是游离VPF的3.57倍。治疗组肿瘤中HIF-1α和乳酸水平下降，T细胞耗竭标志物PD-1/TIM3表达降低。NanoTAC(+L)组实现60%完全缓解，组织学显示广泛细胞死亡，且主要器官无损伤。

Innate and adaptive immune responses in primary and recurrent TNBC

免疫分析显示肿瘤内CRT⁺细胞增加，DC和CTL浸润提升1.42-1.73倍，Treg细胞减少44.81%。肿瘤复发模型中，记忆T细胞（T_em）比例升高，血清IFN-γ、TNF-α、IL-6水平显著提升，证实获得性免疫激活。

Prevention of metastatic TNBC formation

Transwell实验表明NanoTAC通过降解HK2抑制Akt1/MMP-9/纤维连接蛋白信号通路，降低肿瘤细胞迁移和侵袭能力。肺转移模型显示NanoTAC(+L)组转移结节数量显著减少，肺组织中CD8⁺IFN-γ⁺细胞浸润增加，生存期延长。

该研究创新性地将PROTAC技术与PDT相结合，通过代谢重编程克服了TME缺氧对光动力治疗的制约。NanoTAC平台具备高载药量（78.55%）、酶触发靶向激活和免疫微环境重塑等多重优势，不仅诱导强烈的焦亡依赖性抗肿瘤免疫，还有效抑制转移和复发。这种超分子自组装策略为PROTAC的临床转化提供了新思路，尤其适用于代谢异常的高度恶性肿瘤。研究结果发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF=39.3），为癌症免疫治疗领域提供了兼顾精准性与安全性的解决方案。