MaGNet：基于网络理论的定量分析揭示小鼠乳腺导管树发育动态

　　本研究针对乳腺形态发生研究缺乏开源量化工具的瓶颈，开发了基于网络理论的MaGNet（Mammary Gland Network analysis tool）分析方法。通过将乳腺全载片图像转化为网络模型，实现了对导管分支节点（nodes）、连接边（edges）和终端芽（TEBs）的高通量量化。该方法成功捕捉到青春期小鼠乳腺导管树的快速扩张（1-1.5月龄增长4倍）和妊娠激素诱导的形态发生（12天暴露后指标增长1.6倍），为乳腺发育和疾病研究提供了可重复的定量分析框架。

　　

在生命科学领域，分支形态发生（branching morphogenesis）是自然界普遍存在的结构模式，从植物的叶脉分枝到动物的器官发育（如肾脏、肝脏、肺部等）均遵循这一规律。特别值得注意的是，雌性小鼠的乳腺腺体在出生后才会完成其分支结构的发育，这一过程主要受青春期激素信号的调控。随着循环雌激素水平升高（通常在4-7周龄），乳腺导管树开始向外生长和延伸，通过全载片成像（whole-mount imaging）可以观察到导管上皮在脂肪垫中的扩张现象，甚至在某些模型中还能看到早期恶性病变的形成。因此，定量分析导管分支的 initiation 和 elongation 已成为评估分子或细胞扰动对乳腺发育影响的关键手段。

尽管分支形态发生的量化分析如此重要，该领域却长期缺乏 robust 且易于推广的分析方法。以往基于网络理论的研究多采用全手动流程或依赖复杂成像技术（如光学投影断层扫描），这些方法不仅缺乏开源工具支持，还需要专业操作技能。这种技术瓶颈严重限制了研究的可重复性和广泛应用。

为此，研究团队开发了 MaGNet（Mammary Gland Network analysis tool）——一个基于网络理论的 computational 分析流程，用于从2D乳腺全载片图像中量化分支形态发生。该方法将导管结构抽象为网络图：节点（nodes）代表分支点或终端芽（TEBs），边（edges）代表连接它们的导管。通过这种抽象，研究人员能够在保留准确性的同时简化分析过程。虽然当前模型侧重于宏观分支动力学，但它具备未来整合边缘方向性或权重（例如营养流、导管厚度或时空重塑）的扩展能力。

研究团队首先利用已验证的工具 NEFI（Network Extraction From Images）从全载片图像中提取网络结构，再通过 Python 的 NetworkX 包进行高通量定量分析。这一流程包括手动追踪导管树、转换为 NEFI 兼容格式、自动计算关键架构指标（如节点数、边数、终端节点数和度分布等）。尽管图像追踪步骤仍需人工参与，但下游分析完全自动化，显著提高了可重复性和适用范围。

为验证 MaGNet 的敏感性，研究人员分析了野生型雌鼠在三个青春期时间点（1个月、1.5个月和2个月）的乳腺样本。结果显示，在1.5月龄时，节点数、边数和终端节点数均比1月龄时增加约4倍，表明导管树在青春期早期经历快速扩张。而从1.5月到2月龄，这些指标仅增长1.3倍，说明发育重点从快速扩张转向结构精细化和成熟。此外，度分布分析显示，约50%的分支节点始终呈现度1（终端）或度3（分叉），表明乳腺导管网络在青春期发育中具有 stereotypical bifurcating 架构。

研究还应用 MaGNet 分析了激素诱导的模拟妊娠模型。通过给未生育野生型小鼠植入缓释雌激素和孕酮 pellets，模拟妊娠期乳腺发育。比较6天和12天暴露后的导管结构，发现12天时分支点、导管段和终端分支数均增加1.6倍，证明 MaGNet 能高分辨率捕捉激素驱动的形态发生变化。

在方法学验证方面，团队评估了用户间变异性和与传统组织学方法的一致性。三名独立用户对同一组图像进行手动追踪后，终端节点 quantification 无显著差异，表明方法具备用户间一致性。与常规 H&E 染色切片的手动导管计数相比，MaGNet 在检测样本间变异时表现出更高敏感性，说明其能更一致地评估导管特征。

关键技术方法包括：使用C57BL/6和Balb/C雌鼠（购自Charles River）的乳腺组织，通过全载片 carmine 染色和 brightfield 显微镜成像，手动追踪导管结构后采用 NEFI 提取网络，并利用 NetworkX 进行网络指标量化（节点数、边数、终端节点、度分布、总树长度和凸包面积等），统计分析采用 Tukey's HSD 检验。

研究结果通过多个维度验证了 MaGNet 的有效性：

• •
  青春期发育量化：成功检测到1至1.5月龄间的快速导管扩张（所有关键指标增长约4倍）和1.5至2月龄间的结构细化（增长1.3倍）。
• •
  度分布分析：揭示乳腺导管树在发育过程中保持分叉架构主导，度2节点（仅方向改变）罕见，表明导管生长具有高方向保真度。
• •
  激素诱导模型应用：在模拟妊娠实验中捕捉到激素驱动的导管 remodeling，证明方法适用于多种生理语境。
• •
  方法学验证：用户间分析一致，且与传统组织学方法相比具备更高敏感性和可重复性。

该研究的结论强调，MaGNet 为乳腺发育研究提供了首个开源、可扩展且易于应用的定量分析框架。通过将复杂的形态发生转化为可计算网络指标，它不仅解决了现有方法在可重复性和可用性方面的局限，还为未来整合自动化追踪和 advanced 拓扑分析（如中心性、聚类系数和路径长度）奠定了基础。这一工具有望推广到其他分支器官系统（如肺、肾、胰腺）和不同模型 organisms，推动发育生物学和疾病研究领域的定量化进展。

论文发表于《Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia》，所有代码已以 annotated Colab Notebook 形式开源，支持社区广泛使用和定制化扩展。