CoCr28Mo6颗粒重复暴露通过激活NLRP3炎症小体信号通路诱导人成骨细胞焦亡及线粒体功能障碍的机制研究

　　本研究针对人工关节无菌性松动中磨损颗粒引发的炎症性骨溶解问题，探讨了钴铬钼(CoCr)颗粒通过诱导内质网应激关键因子DDIT3表达、抑制线粒体自噬(mitophagy)、增加活性氧(ROS)生成，进而激活NLRP3炎症小体信号通路，导致人成骨细胞(hOBs)焦亡(pyroptosis)和白细胞介素(IL)-18分泌的分子机制。研究发现使用线粒体自噬激动剂CCCP可减轻炎症反应，表明维持线粒体功能是调控颗粒诱导炎症的新策略，为防治假体周围骨溶解提供了实验依据。

　　

人工关节置换术是治疗终末期关节疾病的有效手段，然而术后假体磨损产生的金属颗粒可能引发无菌性松动，导致假体失败。磨损颗粒被周围组织细胞吞噬后，会触发炎症反应，破坏成骨细胞与破骨细胞之间的平衡，最终引起假体周围骨溶解。尽管已知巨噬细胞对磨损颗粒的炎症反应由NLRP3炎症小体介导，但成骨细胞作为早期接触磨损颗粒的细胞类型，其炎症应答机制尚不完全清楚。特别是，金属颗粒如何影响成骨细胞的线粒体功能和内质网应激，进而调控NLRP3炎症小体的激活，仍是需要深入探讨的科学问题。

本研究由德国罗斯托克大学医学中心骨科、生物力学和植入物技术研究实验室的Marie-Luise Sellin等完成，发表在《Cell Biology and Toxicology》。研究人员利用从全髋关节置换术患者股骨头中分离的原代人成骨细胞，探讨钴铬钼(CoCr)颗粒重复暴露对NLRP3炎症小体激活的影响及其与线粒体功能障碍的关联。主要技术方法包括：细胞培养与颗粒处理（使用0.01 mg/mL和0.05 mg/mL CoCr颗粒）、细胞活性检测（WST-1法）、细胞死亡分析（乳酸脱氢酶(LDH)活性测定和Live-Dead染色）、基因表达分析（qPCR检测NLRP3、TLR2、TLR4、pro-IL1B、DDIT3、SOD2等mRNA水平）、蛋白分泌测定（ELISA检测IL-18释放）、线粒体功能评估（线粒体膜电位染色）、细胞形态学观察（细胞骨架actin和核DAPI染色）、NLRP3蛋白定位（免疫荧光染色）以及线粒体自噬调控实验（使用激动剂CCCP）。研究样本来源于36例患者（男性20例，平均年龄67±9岁；女性16例，平均年龄70±7岁）的原代细胞。

Influence of TNF and CoCr particles on the viability of human osteoblasts

通过WST-1检测和Live-Dead染色发现，成骨细胞经0.01 mg/mL和0.05 mg/mL CoCr颗粒处理72小时并再激活45分钟后，代谢活性显著降低，死亡细胞比例增加。高浓度颗粒（0.05 mg/mL）导致细胞形态不规则，肌动蛋白纤维缩短且紊乱，表明颗粒暴露具有时间依赖性和浓度依赖性的细胞毒性。

Influence on the expression of TLR and NLRP3 inflammasome-associated genes

qPCR分析显示，颗粒处理显著上调Toll样受体(TLR2、TLR4)、NLRP3和pro-IL1B的mRNA表达，且72小时长时间暴露效果更明显。免疫荧光染色证实NLRP3蛋白在颗粒处理后表达增强，特别是在0.05 mg/mL浓度组。肿瘤坏死因子(TNF)预处理可进一步强化pro-IL1B的转录，表明TNF是有效的炎症启动信号。

Activity of LDH and secretion of IL-18 after exposure to TNF and CoCr particles

LDH活性测定和IL-18分泌实验表明，颗粒重复暴露诱导了焦亡现象，表现为LDH释放增加和IL-18分泌升高。短期（4小时）暴露后重新添加颗粒可激活NLRP3炎症小体，而长期（72小时）暴露则引发细胞内部过程导致的自发炎症反应。

Influence of treatments on mitochondrial genes and the mitochondrial membrane potential

线粒体功能相关基因分析显示，颗粒处理上调内质网应激标记物DDIT3和线粒体抗氧化酶SOD2的表达。线粒体膜电位染色发现颗粒导致线粒体去极化，形态异常，功能受损。使用线粒体自噬激动剂CCCP可减轻炎症反应，改善细胞活性和线粒体功能，表明线粒体自噬在调控颗粒诱导的炎症中起保护作用。

研究结论表明，CoCr颗粒重复暴露可通过诱导DDIT3表达、抑制线粒体自噬、增加ROS产生，从而激活NLRP3炎症小体，导致人成骨细胞焦亡和IL-18释放。TNF预处理可强化这一过程。激活线粒体自噬则能减轻炎症反应，提示维持线粒体功能是缓解磨损颗粒诱导的骨溶解的新策略。该研究不仅深化了对假体周围骨溶解机制的理解，还为靶向线粒体自噬的 therapeutic干预提供了实验依据。