SP1与p23在人乳腺细胞昼夜节律调控中激活芳烃受体靶基因诱导的关键作用

　　本研究针对环境污染物应答关键介质芳烃受体（AHR）的昼夜节律调控机制不明确的问题，通过系统性分析人乳腺细胞中分子辅因子及其互作关系，首次揭示核心时钟组件BMAL1/CLOCK与AHR直接互作，并发现SP1作为正向调节因子、p23作为负向调节因子共同调控AHR的昼夜节律活性，为新一代风险评估中体外方法（NAMs）的应用提供重要理论依据。

　　

当夜幕降临，我们的身体会遵循内在的生物钟节奏调节生理功能，这种约24小时的昼夜节律（circadian rhythm）不仅控制睡眠-觉醒周期，还深刻影响着细胞对外界刺激的应答能力。其中，芳烃受体（Aryl Hydrocarbon Receptor, AHR）作为细胞防御环境污染物（如二噁英）的关键转录因子，其活性是否受生物钟调控一直是个悬而未决的科学问题。以往研究表明，啮齿类动物某些组织中Ahr基因表达呈现昼夜波动，但在人类细胞中缺乏机制层面的证据。这一问题的重要性在于：理解AHR的节律性调控不仅关乎毒性评估的准确性，还对疾病发生和药物时效性治疗具有深远影响。

在此背景下，德国联邦风险评估研究所Melina Mihelakis、Norman Ertych等团队在《Cell Biology and Toxicology》发表研究，首次在人类乳腺上皮细胞中揭示了AHR信号通路与核心生物钟组件BMAL1/CLOCK的直接相互作用，并发现转录因子SP1和分子伴侣p23以相反方向调控AHR的昼夜节律活性。该研究为揭示环境应激与生物钟的交叉对话提供了分子基础，对优化体外毒理学评估模型和昼夜节律相关疾病机制研究具有重要意义。

研究人员主要采用以下关键技术方法：1）利用PER2::LUCIFERASE报告基因系统验证人乳腺细胞（hTERT-HME1和M13SV1）的昼夜同步化效果；2）通过核质分离与内含子特异性引物RT-qPCR检测新生CYP1A1转录本；3）siRNA干扰和质粒过表达技术筛选调控因子；4）免疫共沉淀（Co-IP）结合Western blot分析蛋白互作网络。

Circadian regulation of the CYP1A1 promoter in vitro

通过昼夜同步化处理，研究人员发现二噁英（TCDD）诱导的CYP1A1基因表达呈现明显的24小时节律性波动，峰值出现在24和48小时。而核内新生mRNA检测进一步证实这种节律性源于转录启动水平的调控，而非mRNA稳定性差异。

Circadian expression of the AHR co-activator SP1

尽管AHR及其经典伴侣蛋白（HSP90、XAP2、p23）的mRNA未显示节律性，但Western blot分析发现SP1蛋白水平呈现昼夜振荡，峰值与CYP1A1诱导高峰同步，提示SP1可能是AHR节律性调控的关键介质。

Modulators of circadian associated AHR activity

利用siRNA筛选技术，研究发现p23敲低显著增强同步化细胞中TCDD诱导的CYP1A1表达，而SP1敲低则抑制该反应。值得注意的是，p23的调控作用仅在同步化细胞中显现，表明其功能与生物钟状态密切相关。

SP1 and p23 modulate circadian associated AHR activity

过表达实验证实p23负向调控而SP1正向调控AHR应答的动态范围。剂量反应曲线显示，p23过表达使剂量曲线右移（敏感性降低），而SP1过表达左移（敏感性升高）。这些效应在非同步化细胞中消失，证实二者功能依赖于生物钟完整性。

AHR interaction with the clock core complex BMAL1/CLOCK

免疫共沉淀实验首次证实：在同步化细胞中，AHR/ARNT复合物与核心时钟蛋白BMAL1/CLOCK存在直接相互作用。且BMAL1免疫沉淀物中可检测到SP1和AHR，提示BMAL1/CLOCK可能作为分子桥梁连接生物钟机器与AHR信号通路。

研究结论强调，AHR的昼夜节律性调控并非通过其自身或经典伴侣基因的转录振荡实现，而是通过核心时钟组件BMAL1/CLOCK与AHR/ARNT复合物的直接互作，并受到SP1（正向）和p23（负向）的协同调节。这一发现不仅解释了人类细胞中AHR活性昼夜差异的分子基础，还为毒性评估模型引入生物钟维度提供了理论支持。鉴于昼夜节律紊乱与乳腺癌等疾病的密切关联，该研究也为理解环境污染物与生物钟互作在疾病发生中的作用提供了新视角。