基因工程乳酸乳球菌靶向IL-6Rα单链抗体开发及其对血清淀粉样蛋白A的抑制作用研究

　　本研究针对IL-6信号通路异常激活引发的炎症性疾病治疗成本高昂的问题，开发了能高效表达靶向IL-6Rα单链抗体（IL-6RαscFv）的基因工程乳酸乳球菌（gmLAB）。该菌株表达的IL-6RαscFv能特异性结合人IL-6Rα并有效抑制IL-6/IL-6Rα相互作用，显著降低HepG2细胞中急性期炎症标志物血清淀粉样蛋白A（SAA）的表达水平，为炎症性疾病提供了低成本生物治疗新策略。

　　

炎症反应是机体防御的重要机制，但白细胞介素6（IL-6）信号通路的异常激活却会导致多种慢性炎症性疾病。当IL-6与其受体IL-6Rα结合后，会激活gp130信号转导分子，引发Janus激酶（JAK）-信号转导与转录激活因子3（STAT3）等下游信号通路，导致C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A（SAA）等急性期蛋白的异常升高。这种信号通路失调与类风湿关节炎、炎症性肠病、阿尔茨海默病和多种癌症的发生发展密切相关。

目前临床上使用抗IL-6Rα单克隆抗体（如sarilumab、tocilizumab等）来阻断IL-6信号通路，但这些生物制剂生产成本高昂，给患者带来沉重经济负担。近年来，基因工程乳酸菌（gmLAB）作为低成本治疗剂平台受到广泛关注，其能够高效表达治疗性蛋白，并通过黏膜递送方式实现治疗目的。单链可变片段（scFv）作为抗体的最小功能单元，具有分子量小、免疫原性低、易于细菌表达等优势，成为传统单克隆抗力的理想替代品。

在这项发表于《Current Microbiology》的研究中，日本信州大学的研究团队Masahiro Yoda等人开发了一种能表达抗IL-6Rα单链抗体的基因工程乳酸乳球菌，并系统评估了其抑制IL-6信号通路的生物学功能。

研究人员采用的主要技术方法包括：利用nisin诱导表达系统（NICE）构建重组质粒；通过电转染技术获得基因工程菌株；使用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测表达产物；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）分析抗原结合活性；通过体外细胞实验验证炎症抑制效果；运用分子对接技术（Z-DOCK 3.0.2）预测蛋白质相互作用模式。所有实验均使用标准分子生物学和细胞生物学方法完成。

Development of a Genetically Modified Lactococcus lactis Strain that Produces a Single-Chain Variable Fragment Targeting Interleukin-6 Receptor a to Suppress Serum Amyloid A

研究人员首先基于抗IL-6Rα单克隆抗体sarilumab的互补决定区序列，设计了特异性靶向IL-6Rα的单链抗体（IL-6RαscFv）。该scFv由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过GGGGSGGGGSGGGGS柔性 linker连接而成，分子量为29.1 kDa。利用SWISS-MODEL预测的三维结构显示，该scFv具有典型的抗体结合域结构。

Construction of the IL-6RascFv-producing gmLAB,and Confirmation and Optimization of IL-6RascFv Expression by the gmLAB

研究团队成功构建了重组表达载体pNZ8148#2:CYT-IL-6RαscFv，并通过电转染技术将其导入乳酸乳球菌NZ9000中，获得工程菌株NZ-IL6RαscFv。Western blot分析证实，该菌株在nisin诱导后能有效表达IL-6RαscFv，而未诱导对照组和空载体对照组均无相应条带。时间梯度实验显示，诱导后3小时表达量达到峰值，6小时后明显下降，表明该重组蛋白在细菌体内稳定性有限。

Immunoreactivity of IL-6RascFv

通过ELISA实验验证了rIL-6RαscFv的免疫反应性。结果显示，NZ-IL6RαscFv细胞提取物能剂量依赖性地结合人IL-6Rα（hIL-6Rα），而空载体对照组无此现象。值得注意的是，该scFv不与小鼠IL-6Rα（mIL-6Rα）发生交叉反应，序列比对分析表明这可能源于物种间IL-6Rα关键结合位点的氨基酸差异。

Ability of rIL-6RascFv to Inhibit IL-6 Binding to IL-6Ra

竞争性ELISA实验证明，纯化的rIL-6RαscFv能剂量依赖性地抑制IL-6与IL-6Rα的结合。当scFv浓度达到25 ng/mL时，抑制效果最为显著。阳性对照sarilumab也显示出类似的抑制效果，而阴性对照人IgG则无抑制作用，证实了该检测体系的可靠性。

Confirmation of rIL-6RascFv Bioactivity in HepG2 Cells and Comparison with Sarilumab

在HepG2人肝癌细胞模型中，研究人员评估了rIL-6RαscFv的炎症抑制功能。实验发现IL-6能剂量依赖性地诱导SAA1表达，50 ng/mL IL-6刺激效果最为显著。使用10 ng/mL rIL-6RαscFv预处理30分钟后，IL-6诱导的SAA1表达被显著抑制（p<0.05）。特别值得注意的是，在相同摩尔浓度（0.34 nM）下，rIL-6RαscFv与sarilumab的抑制效果相当，表明这种小分子抗体具有与全长抗体相似的生物活性。

分子对接分析（Z-DOCK 3.0.2）预测了IL-6Rα/rIL-6RαscFv复合物的可能结构。结果显示，scFv可能结合于IL-6Rα的D2和D3结构域，这与sarilumab的作用位点相似，解释了为何两者具有相当的抑制效能。

该研究成功开发了能高效表达抗IL-6Rα单链抗体的基因工程乳酸乳球菌，其表达产物具有良好的生物学活性和特异性。rIL-6RαscFv能有效抑制IL-6与IL-6Rα的结合，并显著降低炎症标志物SAA的表达，为炎症性疾病的治疗提供了新思路。

这项研究的重要意义在于：首先，基因工程菌株生产scFv的成本远低于传统单克隆抗体生产技术，有望大幅降低治疗费用；其次，scFv分子量小、免疫原性低，具有更好的组织穿透性和安全性；最后，乳酸菌作为递送载体，可通过黏膜给药方式实现局部治疗，提高治疗效果并减少全身副作用。

尽管该研究在体外实验中取得了令人鼓舞的结果，但由于rIL-6RαscFv不结合小鼠IL-6Rα，无法在常规小鼠模型中进行体内功效评价。研究人员建议未来使用人源化IL-6R基因敲入小鼠模型进行后续研究，特别是在类风湿关节炎等慢性炎症性疾病模型中评估该工程菌的治疗效果。

总之，这项研究为开发低成本、高效的炎症性疾病生物治疗剂提供了重要技术平台，代表了基因工程菌治疗领域的重要进展。