CD137L通过HLTF调控增强黑色素瘤免疫监视：AMPK激动剂AICAR联合免疫检查点阻断治疗新策略

　　本研究针对免疫检查点阻断疗法（ICB）在黑色素瘤中的响应率局限问题，通过多组学分析发现CD137L表达与PD-1阻断疗效正相关。机制研究表明HLTF通过结合CD137L启动子抑制其转录，而AMPK激动剂AICAR通过磷酸化HLTF Ser398位点解除抑制，显著增强CD8+ T细胞抗肿瘤免疫。临床前实验证明AICAR与抗CTLA-4/PD-1抗体联用产生协同抑瘤效果，为提升免疫治疗响应提供了新靶点和组合策略。

　　

免疫治疗彻底改变了癌症治疗格局，其中免疫检查点阻断（ICB）疗法通过调控免疫刺激或免疫抑制分子的信号通路，显著延长了患者生存期。抗PD-1和抗CTLA-4等免疫检查点抑制剂在晚期黑色素瘤患者中显示出临床疗效，但仍有相当比例患者对治疗无响应，这凸显了寻找额外免疫检查点分子作为治疗靶点的迫切需求。

CD137（4-1BB，TNFRSF9）是主要表达于活化T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞的共刺激免疫检查点，其唯一已知天然配体CD137L（4-1BBL，TNFSF9）通常表达于抗原呈递细胞（APCs）。CD137L作为TNF超家族（TNFSF）的II型跨膜蛋白，以三聚体形式存在，与T细胞上的受体结合后招募特定TNF受体相关因子（TRAF1、TRAF2和TRAF3），触发NF-κB、ERK、JNK和p38 MAPK等下游信号通路，传递强大的共刺激信号增强T细胞活化。然而，针对CD137的激动性抗体临床开发面临重大挑战：urelumab因不可耐受的肝毒性暂停开发，utomilumab则因疗效不足受限。

除了作为CD137配体的功能外，CD137L还能通过反向信号传导在不同细胞类型中发挥独特作用。虽然CD137L主要在APCs中表达，但在多种癌症中观察到其肿瘤细胞中的异常表达，且对肿瘤进展产生不同影响：在胰腺癌中促进耐药性，在结肠癌中支持转移。因此，在将激动性抗CD137抗体或CD137-CD137L信号阻断应用于临床前，必须充分理解CD137-CD137L相互作用在特定恶性肿瘤中的作用。

本研究通过整合多组学数据发现，肿瘤CD137L表达与PD-1阻断疗效呈正相关。功能实验表明，癌细胞中诱导CD137L能显著增强抗肿瘤免疫力，促进CD8⁺ T细胞存活。机制上，解旋酶样转录因子（HLTF）被鉴定为CD137L的关键转录调节因子，通过丝氨酸398位点（Ser398）的磷酸化控制其表达。治疗方面，AMPK激动剂AICAR（acadesine）作为CD137L诱导剂，与PD-1或CTLA-4阻断表现出协同效应。这些发现不仅阐明了控制CD137L表达的机制，更为增强黑色素瘤ICB疗效提供了有前景的联合治疗策略。

研究主要采用了以下关键技术方法：基于TCGA和10个独立免疫治疗队列的多组学数据分析；29例黑色素瘤患者样本的免疫荧光检测；单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析细胞群体表达特征；体外T细胞杀伤实验评估免疫细胞毒性；DNA pull-down联合质谱技术鉴定启动子结合蛋白；染色质免疫沉淀（ChIP）和荧光素酶报告基因验证转录调控；免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白互作；磷酸化位点突变体功能验证；免疫健全小鼠体内肿瘤模型评估治疗效应；流式细胞术和多重免疫组化分析肿瘤免疫微环境。

CD137L表达水平与黑色素瘤患者PD-1单抗治疗效果相关

免疫反应由抑制性和共刺激性检查点共同调控。分析发现CD137/CD137L（TNFRSF9/TNFSF9）表达水平与6个独立免疫治疗队列（包括黑色素瘤、肺癌和头颈癌）的更好总生存期（OS）或无进展生存期（PFS）相关。与已知生物标志物（PD-L1和CD8基线水平）相比，CD137L在更多数据集中表现出更好的响应区分性能。对29例抗PD-1抗体治疗的黑色素瘤患者样本分析显示，高CD137L表达显著区分患者对PD-1单抗治疗的反应性，且与更长PFS相关。单细胞RNA测序数据显示黑色素瘤细胞群体中CD137L阳性细胞比例极低，但部分细胞表现出升高表达，提示肿瘤免疫原性增强。黑色素瘤患者CD137L表达显著低于健康供体的良性病例，较高CD137L表达水平与改善的总生存期相关。

CD137L过表达在免疫健全小鼠和黑色素瘤细胞中增强癌症免疫监视

在A375、SK-MEL-28和B16F10细胞中过表达CD137L不影响黑色素瘤细胞生长。免疫缺陷（SCID）裸鼠体内致瘤实验显示CD137L过表达对肿瘤细胞增殖无显著影响。在免疫健全小鼠中，CD137L过表达显著抑制肿瘤生长而不影响体重，并延长生存期。黑色素瘤中免疫细胞浸润分析显示CD137L与CD8⁺ T细胞呈正相关。流式细胞术分析显示CD137L过表达组中CD3⁺和CD8⁺ T细胞群体增加，GZMB⁺ CD8⁺ T细胞比例显著增加，而其他细胞类型无显著变化，活化T细胞（Ki67⁺）增加，巨噬细胞减少。肿瘤组织免疫荧光染色进一步证实CD137L过表达组中活化CD8⁺ T细胞浸润显著增加。体外T细胞杀伤实验表明CD137L敲低抑制T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，而过表达显著增强T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。

HLTF作为负调控因子控制CD137L转录

CD137L在黑色素瘤中低表达，其上调代表有前景的治疗策略。评估黑色素瘤中CD137L基因启动子甲基化状态发现与癌旁组织无显著差异。DNA pull-down assay鉴定与CD137L启动子区域结合的蛋白质，质谱分析发现179个候选蛋白。TCGA数据分析显示HLTF是与CD137L表达负相关性最显著的转录因子。实验验证证实HLTF直接结合黑色素瘤细胞系中CD137L启动子。荧光素酶报告实验显示HLTF过表达以剂量依赖性方式抑制CD137L启动子驱动的双荧光素酶表达。ChIP实验证实HLTF内源性结合CD137L启动子。HLTF过表达降低CD137L mRNA和蛋白水平以及膜结合CD137L含量，而敲低或敲除HLTF显著上调CD137L表达和膜相关CD137L水平。HLTF表达与肿瘤免疫细胞浸润分析显示HLTF和CD137L同时存在时CD8⁺ T细胞水平显著降低，表明HLTF可能在CD8⁺ T细胞活化中起负调控作用。体外T细胞杀伤实验表明HLTF敲低显著增强T细胞介导的肿瘤细胞毒性，而过表达保护肿瘤细胞免受T细胞诱导的杀伤。免疫健全小鼠体内致瘤实验显示B16F10细胞系中敲低或敲除HLTF显著抑制肿瘤生长而不影响体重，并延长小鼠生存期。流式细胞术分析显示HLTF敲低和敲除组中CD137L表达上调，肿瘤中CD8⁺ T细胞浸润显著增加，GZMB⁺活化T细胞比例明显更高。免疫荧光分析显示HLTF敲除组中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺和GZMB⁺ T细胞浸润显著增强。

HLTF通过Ser398位点磷酸化调控CD137L表达

分析PhosphoSitePlus数据库公共质谱数据鉴定HLTF上多个磷酸化位点。AMPK激酶激动剂GSK621和AICAR显著增加CD137L表达，而AMPK抑制剂dorsomorphin下调膜定位CD137L水平。免疫沉淀实验证实磷酸化AMPK与HLTF相互作用。进一步分析显示AMPK与HLTF的SNF2-N和ZFC结构域结合。免疫荧光显微镜显示HLTF和AMPK在细胞核中共定位，AICAR处理增强这种共定位。AICAR处理后磷酸化AMPK与HLTF的结合加强，HLTF磷酸化水平升高。将397、398、397/398、400、421和635位丝氨酸突变为丙氨酸模拟去磷酸化状态，发现398位丝氨酸突变显著抑制AICAR诱导的HLTF磷酸化。DNA pull-down和ChIP实验显示AICAR处理后HLTF与CD137L启动子的结合减少。

黑色素瘤细胞经AICAR处理后转录组分析显示AMPK相关通路活化增加，包括MAPK和cAMP信号通路。免疫检查点表达分析显示CD137L是上调最显著的检查点。用不同浓度AICAR处理黑色素瘤细胞系显示CD137L蛋白和mRNA水平呈剂量依赖性增加，膜定位CD137L增强，而对永生化角质形成细胞HaCaT无影响。其他AMPK激动剂Metformin和GSK621也增加膜水平CD137L蛋白。不同浓度AICAR处理免疫健全荷瘤小鼠显著抑制肿瘤生长并促进T细胞浸润和活化，而对肿瘤中其他细胞（NK、B、DC、M2巨噬细胞）含量无显著影响。T细胞杀伤实验证明AICAR显著增强T细胞介导的细胞毒性。使用CD137L敲除小鼠细胞系生成肿瘤的实验表明，缺乏CD137L时肿瘤生长加速，AICAR的抗肿瘤效应在CD137L敲除组中消失，肿瘤中T细胞浸润和活化减少。同时，B细胞、M2巨噬细胞和树突状细胞中CD137L含量在AICAR处理后基本未改变。体外实验获得类似结果：CD137L敲低后AICAR预处理废除了AICAR增强T细胞细胞毒性的能力。HLTF过表达后AICAR处理显示，野生型HLTF和S398A突变体均抑制AICAR增强的T细胞杀伤肿瘤细胞能力，而S398D突变（丝氨酸398被天冬氨酸取代以模拟HLTF磷酸化）恢复AICAR增强T细胞细胞毒性的能力，与单独AICAR处理效果相似。

CD137L诱导剂与PD-1单抗或CTLA-4单抗治疗在黑色素瘤临床前小鼠模型中的协同效应

CTLA-4和PD-1单克隆抗体的应用标志着肿瘤免疫治疗的重大进展，但仍有进一步提升疗效的空间。联合不同治疗药物是提高治疗效果的 promising 策略。作为独立于CTLA-4和PD-1通路的共刺激检查点，CD137L成为联合治疗的潜在靶点。AICAR作为特异性AMPK激动剂，目前已临床用于治疗和预防心脏缺血性损伤。为评估AICAR在黑色素瘤免疫治疗中的潜力，将低剂量AICAR与临床批准的免疫检查点抑制剂抗CTLA-4和抗PD-1单克隆抗体联合使用。结果显示AICAR单独抑制肿瘤生长，而与抗CTLA-4和抗PD-1抗体联合时，肿瘤生长抑制显著优于单药治疗。主要器官（心、肝、脾、肺、肾和皮肤）的组织学分析以及肝肾功能和血细胞计数显示联合治疗组无明显毒副作用。联合治疗组肿瘤体积显著减小，小鼠生存期较单药治疗延长。免疫荧光分析显示联合治疗组肿瘤微环境中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T细胞和GZMB⁺ CD8⁺ T细胞显著增加。流式细胞术显示AICAR与CTLA-4单抗或PD-1单抗联合时CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T细胞和活性GZMB⁺ CD8⁺ T细胞显著增加。其他类型T细胞和免疫细胞分析显示联合使用时M2巨噬细胞、Treg细胞和耗竭T细胞减少，增殖T细胞（Ki67⁺）增加，NK细胞无显著变化。

研究表明，活化AMPK可磷酸化HLTF以增强CD137L表达，从而激活T细胞清除黑色素瘤细胞。AMPK激动剂AICAR与CTLA-4或PD-1免疫检查点阻断抗体联合显著抑制免疫健全小鼠中的黑色素瘤生长。此外，CD137L表达特征可作为患者抗PD-1治疗响应性的预测生物标志物。CD137L在黑色素瘤细胞中的低表达有助于免疫逃逸，与其他肿瘤类型相比，CD137L介导的反向信号通路在黑色素瘤中似乎不起重要作用。因此，在黑色素瘤细胞中提升CD137L表达代表一种有前景的治疗策略。

HLTF作为SWItch/Sucrose Non-Fermenting（SWI/SNF）家族成员，在染色质重塑中起关键作用。本研究发现在黑色素瘤中，HLTF结合CD137L启动子抑制其表达，敲低或敲除HLTF导致CD137L表达增加和T细胞活化增强，表明HLTF高表达可能有助于黑色素瘤免疫逃逸。AMPK介导的HLTF磷酸化解除对CD137L表达的抑制，AMPK激动剂也显著上调CD137L并与CTLA-4或PD-1阻断抗体协同作用。

尽管PD-1抗体的临床应用显著改善患者生存，但总体响应率仍不理想，需要可靠生物标志物预测治疗效果。AICAR诱导的CD137L上调显著增强PD-1抗体的抗肿瘤效果，表明CD137L表达与PD-1治疗响应相关。肿瘤分析进一步显示CD137L表达升高的患者在PD-1单抗治疗后表现出更好预后。虽然针对CD137的特异性单克隆抗体临床开发面临挑战，但第二代药物采用创新策略克服这些限制，包括靶向肿瘤抗原或基质标志物的双特异性/三特异性格式、Fc沉默减少系统性毒性、表位优化和一些采用条件活化或 uneven 结合位点比例增强聚集。PD-1单抗和CD137单抗联合可能增强治疗效果和响应率，但也可能带来显著副作用。一种有前景的临床方法可能涉及使用低毒性小分子或药物（如AICAR或metformin）激活AMPK或选择性上调肿瘤细胞中CD137L表达，这种策略与免疫检查点抑制剂联合可能为肿瘤提供可行的治疗选择。