游离型和整合型乙型肝炎病毒转录组图谱揭示异质性及其潜在的耐药性

　　本研究利用靶向长读长测序技术，首次在未经治疗的慢性乙型肝炎患者肝活检样本中系统解析了HBV cccDNA和整合DNA的转录组异质性。研究人员发现整合DNA来源的转录本占病毒RNA的98%，其3'端病毒-宿主嵌合结构高度多样，且40%的转录本缺失现有反义寡核苷酸(ASO)和siRNA疗法的靶向位点，揭示了病毒逃避治疗的潜在机制。同时，研究证实cccDNA是病毒遗传多样性的主要来源，而整合DNA则稳定表达表面抗原(HBs)。该研究为优化靶向治疗策略提供了重要理论依据，发表于《Nature Communications》。

　　

在全球范围内，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染影响着超过2.5亿人，是肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌的重要致病因素。尽管现有核苷（酸）类似物能够有效抑制病毒复制，但无法彻底清除肝细胞核内的共价闭合环状DNA（cccDNA）——这种微染色体结构的病毒基因组持久存在于感染细胞中，成为治愈乙肝的主要障碍。与此同时，病毒DNA整合入宿主基因组的现象与肝癌发生密切相关，但整合DNA（iDNA）的转录特征及其临床意义尚不明确。更复杂的是，重叠的病毒RNA转录本使得准确解析HBV转录组变得异常困难，而当前靶向cccDNA的表观遗传修饰剂、小干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO）疗法的开发，正迫切需要对这些转录来源进行精确区分和深入理解。

为了解决这些难题，由英国牛津大学Jane A. McKeating教授领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新成果。他们采用靶向长读长测序技术，对11例未经治疗的HBeAg阴性慢性乙肝患者的肝活检样本进行了高分辨率转录组分析。研究人员通过生物素化探针富集HBV RNA，利用PacBio长读长平台进行测序，并结合体外感染模型（HepG2-NTCP细胞感染HBV基因型D），成功绘制了包括剪接变异体、截短转录本和病毒-宿主嵌合RNA在内的完整转录图谱。

研究的主要技术方法包括：使用探针捕获技术富集HBV转录本；采用PacBio长读长测序平台获得全长转录本信息；通过数字液滴PCR（ddPCR）定量cccDNA；利用免疫组化检测肝组织中HBcAg和HBsAg表达；以及进化树分析（IQ-tree）解析病毒群体遗传关系。

Defining the HBV transcriptome

研究人员首先通过RT-qPCR检测46例慢性乙肝患者肝组织中的总HBV RNA和前基因组RNA（pgRNA），发现HBeAg阴性患者中pgRNA占比显著降低（约4%）。选择11例基因型D的HBeAg阴性患者进行后续分析，探针富集后获得高质量的测序数据（中位数27,956条病毒读长）。他们不仅验证了已知的转录起始位点（TSS），还发现了大量新型启动子相关转录本（C-AT1、C-AT2、Sp1-AT、Sp2-AT和X-AT），这些转录本约占病毒转录组的37%。

Ascribing HBV transcripts to cccDNA or iDNA

通过分析转录本3'端特征，研究人员开发了一种创新方法区分cccDNA来源转录本（ccc-RNA）和整合DNA来源转录本（id-RNA）。结果显示，临床样本中98%的病毒RNA来自整合DNA，而体外感染模型中98%的转录本来自cccDNA。在ccc-RNA中，启动子活性存在较大异质性，而id-RNA中Sp2启动子驱动的转录本占主导（>70%）。值得注意的是，X启动子在两种模板中均保持活性，贡献了高达12%的转录组。

Characterisation of HBV integrant derived transcripts

对嵌合转录本的分析揭示了病毒-宿主连接处的惊人多样性。每个患者平均有390个不同的整合位点，其中样本1036中94%的嵌合转录本映射到单一基因座（NC_000020.11），提示克隆性扩张。这些嵌合RNA的3'非病毒序列长度差异达5个数量级，且所有编码S基因开放阅读框（ORF）的id-RNA都包含2495位的终止密码子，不会产生融合蛋白。免疫组化证实10/11的组织样本中存在胞质HBsAg表达，证明这些转录本确实被翻译。

Genetic diversity of cccDNA and iDNA derived HBV transcripts

通过分析preS2区域（1650-2495）的遗传变异，发现ccc-RNA比id-RNA更具多态性，某些位点的变异率高达50%。系统进化分析显示，在同时含有足够ccc-RNA和id-RNA的样本1031中，ccc-RNA分为11个进化枝，而id-RNA仅分为4个进化枝。部分整合枝（如枝A）与任何ccc-RNA进化枝均无关联，可能代表历史感染事件，而ccc-RNA进化枝1和2与id-RNA进化枝B和D完全相同，反映了活跃的病毒复制和近期整合事件。

研究结论表明，整合DNA是慢性乙肝患者病毒转录组的主要来源，其转录本具有高度异质性，特别是在3'端病毒-宿主连接处。这种多样性对当前靶向DR2-DR1区域的反义寡核苷酸疗法（如Bepirovirsen）构成了重大挑战，因为约40%的id-RNA缺乏该靶向 motif。同时，cccDNA作为病毒遗传多样性的主要驱动力，持续产生具有免疫逃逸潜能的变异株，而整合DNA则提供了一个稳定的抗原表达库。

该研究的深刻意义在于首次在临床样本中系统揭示了HBV转录组的全貌，提供了区分cccDNA和整合DNA转录活性的方法学框架。这些发现对当前针对HBV的基因治疗策略提出了重要警示：必须同时针对cccDNA和整合DNA的转录特征设计多重靶向治疗方案。此外，研究证实整合DNA能够稳定表达HBsAg和HBx蛋白，这为理解慢性感染状态下抗原持续存在的机制提供了新视角，也为开发治疗性疫苗和免疫预防策略指明了方向。该研究建立的靶向长读长测序和分析流程为未来研究不同HBV基因型的转录组特征奠定了坚实基础。