抗血小板药物Vorapaxar通过激活FOXO1/HMOX1轴增强线粒体相关铁死亡以增效癌症免疫治疗

　　本研究针对免疫治疗抵抗和癌症相关血栓栓塞双重挑战，发现FDA批准的抗血小板药物Vorapaxar可通过直接结合FOXO1、抑制其Ser256位点磷酸化并促进核转位，转录上调HMOX1表达，诱导线粒体铁过载和线粒体相关铁死亡。该机制在黑色素瘤移植模型、自发模型和人源化小鼠模型中均显著增强抗PD-1疗效，且FOXO1/HMOX1高共表达患者呈现更好的免疫治疗应答和生存获益，为兼具抗血栓和增效免疫治疗的双重策略提供新视角。

　　

免疫治疗尤其是免疫检查点抑制剂（ICBs）的出现，为癌症治疗带来了革命性的突破。然而，仍存在两个棘手难题：一是相当比例患者会产生获得性耐药，二是免疫相关不良事件（irAEs）中，癌症相关血栓栓塞是导致死亡的主要原因。这提示我们，亟需开发既能预防血栓形成、又能克服免疫治疗抵抗的双效策略。

近年来，铁死亡（ferroptosis）——一种铁依赖性的、以脂质过氧化为特征的细胞程序性死亡方式——被认为是一种有潜力的免疫治疗增敏策略。研究表明，ICBs激活的CD8⁺ T细胞能通过干扰素-γ（IFN-γ）下调胱氨酸/谷氨酸逆向转运体（xCT）亚基，从而诱导肿瘤细胞发生铁死亡。与此同时，抗血小板药物在癌症患者中常被用于预防血栓，但其是否能调控肿瘤铁死亡并与免疫治疗产生协同效应，此前尚不明确。

在此背景下，研究人员开展了一项系统性的药物筛选研究。他们从20种FDA批准的抗血小板药物中，发现蛋白酶激活受体1（PAR1）抑制剂Vorapaxar能显著增强铁死亡诱导剂RSL3（一种GPX4抑制剂）在黑色素瘤细胞中的杀伤效果。进一步的机制研究表明，Vorapaxar并非通过其经典靶点PAR1发挥作用，而是直接与转录因子FOXO1结合，抑制其Ser²⁵⁶位点的磷酸化，促进其核转位，进而转录上调血红素加氧酶1（HMOX1）的表达。HMOX1的升高导致线粒体内铁离子过载和脂质过氧化物积累，最终诱导线粒体相关铁死亡（mitochondria-associated ferroptosis）。

为了验证这一机制，研究团队运用了多种体内外模型：在免疫缺陷鼠移植瘤模型（A375细胞）中，Vorapaxar能显著增强铁死亡诱导剂（IKE）的抗肿瘤效果，且该效应可被铁死亡抑制剂Lip-1、HMOX1抑制剂ZnPP或FOXO1抑制剂AS1842856所逆转；在免疫健全的C57BL/6小鼠B16F10移植瘤模型和基因工程自发黑色素瘤模型（Tyr::CreER^+/-; Braf^CA/wt; Pten^lox/lox）中，Vorapaxar与抗PD-1联用表现出强大的协同抗肿瘤效应，显著抑制肿瘤生长并延长生存期；在更接近人体免疫环境的外周血单核细胞（PBMC）人源化小鼠模型中，联合治疗同样显著增效。

临床意义方面，研究团队分析了来自湘雅医院和已发表队列的接受ICBs治疗的黑色素瘤患者数据，发现FOXO1与HMOX1共高表达的患者，其肿瘤组织中铁死亡通路、CD8⁺ T细胞浸润、T细胞炎症基因表达谱（GEP）和细胞毒性活性（CYT）均显著升高，且对免疫治疗的应答率更高、无进展生存期更长。这表明FOXO1/HMOX1轴可作为预测免疫治疗疗效的潜在生物标志物。

本研究综合运用了高通量药物筛选、分子对接与生物层干涉技术（BLI）、细胞热转移 assay（CETSA）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、RNA测序（RNA-seq）、流式细胞术、免疫组化与多色荧光染色、基因敲除/敲低（CRISPR-Cas9/siRNA）以及多种小鼠模型（移植瘤、自发瘤、人源化模型）等关键技术方法，其中临床样本分析包含了来自湘雅医院的62例接受抗PD-1治疗的黑色素瘤患者队列和已公开的Ribas队列（n=437）。

Screening of the antiplatelet drugs to identify vorapaxar as pro-ferroptotic agent in cancer cells

通过系统筛选20种FDA批准的抗血小板药物，发现Vorapaxar能显著增强铁死亡诱导剂RSL3在黑色素瘤细胞A375和SK-MEL-28中的杀伤作用，且该效应可被铁死亡抑制剂（Fer-1、DFO）逆转，而非凋亡、坏死性凋亡或自噬抑制剂。

Vorapaxar combined with RSL3 induce mitochondria-associated ferroptosis primarily through upregulating mitochondrial HMOX1

RNA-seq提示联合处理显着富集于线粒体相关通路。电镜观察发现联合处理导致线粒体萎缩、嵴减少。进一步研究发现，联合处理诱导线粒体铁积累和脂质过氧化，且这些效应依赖于HMOX1的上调，因其可被HMOX1抑制剂ZnPP或基因敲低所逆转。

Vorapaxar facilitates mitochondria-associated ferroptosis by targeting the FOXO1/HMOX1 axis

机制上，Vorapaxar直接与FOXO1蛋白结合（BLI和CETSA验证），抑制其Ser²⁵⁶磷酸化，促进其核转位，进而转录上调HMOX1。FOXO1的抑制或敲低可逆转联合处理诱导的铁死亡，而其过表达则 sensitizes 细胞对铁死亡的敏感性。

Vorapaxar-enhanced ferroptosis inhibits tumor growth through the FOXO1/HMOX1 axis

在体内，Vorapaxar能显著抑制GPX4敲除的A375移植瘤的生长，并增强IKE在移植瘤和Braf/Pten自发黑色素瘤模型中的疗效，这些效应均依赖于FOXO1/HMOX1轴。

Vorapaxar potentialtes anti-PD-1 immunotherapy in suppressing melanoma by promoting ferroptosis

Vorapaxar与抗PD-1联用，在B16F10移植瘤和Braf/Pten自发黑色素瘤模型中均展现出强大的协同抗肿瘤效果，表现为肿瘤生长抑制、生存期延长、肿瘤内铁死亡标志物4-HNE升高以及CD8⁺ T细胞功能（IFN-γ、GZMB）增强。

Upregulation of FOXO1/HMOX1 axis correlated with the efficacy of improved immunotherapy

对临床队列的分析表明，FOXO1与HMOX1共高表达的黑色素瘤患者具有更高的铁死亡评分、CD8⁺ T细胞浸润和细胞毒性活性，且对免疫治疗的应答率和无进展生存期更优。

本研究结论表明，抗血小板药物Vorapaxar可通过一种不依赖于其经典靶点PAR1的“脱靶”机制，直接靶向FOXO1并调控其转录活性，通过FOXO1/HMOX1轴诱导线粒体相关铁死亡。该机制不仅与铁死亡诱导剂产生强大协同效应，更能显著增强免疫检查点抑制剂在多种临床前模型中的抗肿瘤免疫应答。其重要意义在于：一方面，为克服免疫治疗抵抗提供了通过诱导铁死亡的新策略；另一方面，Vorapaxar作为一种已获批用于心血管疾病的药物，其双重作用（抗血栓+增效免疫治疗）尤其适合那些需要同时进行抗血栓预防和免疫治疗的癌症患者，具有极高的临床转化潜力。FOXO1/HMOX1轴的发现不仅阐明了Vorapaxar的作用机制，也为预测免疫治疗疗效提供了一个潜在的生物标志物。