裂解性噬菌体中甲氧苄啶抗性基因的进化选择及其对感染过程中噬菌体与宿主适应性的影响

　　本刊推荐：为解决抗生素耐药性（ARGs）传播机制问题，研究人员开展裂解性噬菌体携带功能性耐药基因的主题研究。通过宽松阈值搜索结合机器学习结构相似性分析，发现9419个潜在ARGs，其中甲氧苄啶耐药基因（dfrA）可增强细菌耐药性并促进噬菌体繁殖。该研究揭示了裂解性噬菌体与宿主间进化互惠的新机制，对耐药基因传播风险评估具有重要科学意义。

　　

抗生素耐药性已成为全球公共卫生领域的重大威胁，每年导致数百万人死亡并造成巨额经济损失。细菌通过获得抗生素耐药基因（ARGs）产生耐药性，这些基因可通过质粒、转座子等移动遗传元件在不同菌株间传播。近年来研究发现，温和噬菌体和前噬菌体可作为ARGs的重要载体，但裂解性噬菌体是否携带功能性ARGs一直存在争议。传统观点认为裂解性噬菌体不携带ARGs，但这一认知主要基于严格阈值（序列一致性≥80%，查询覆盖度≥85%）的筛选标准。若采用宽松阈值，病毒组研究中曾发现少数潜在ARGs，包括两个功能性β-内酰胺酶。这一矛盾提示我们需要重新审视裂解性噬菌体中ARGs的分布与功能。

为系统探究裂解性噬菌体中ARGs的存在与功能，研究人员采用宽松阈值搜索策略结合机器学习结构相似性分析方法（PCM），对NCBI数据库中26,697个噬菌体基因组进行大规模分析。研究团队首先通过敏感性分析发现，使用≥50%一致性阈值会显著减少潜在ARGs的检出数量，特别是在裂解性噬菌体中仅能识别125个潜在ARGs。这表明传统严格标准可能遗漏大量高度分化但仍具功能潜力的噬菌体编码ARGs。

通过BLASTp同源性搜索、HMMScan保守结构域筛查和PCM结构相似性分析三种方法，研究人员共鉴定出11,665个潜在ARGs，分布在4,989个噬菌体基因组中（占总数的18.69%）。其中98.63%的潜在ARGs与已报道的细菌ARGs的氨基酸序列一致性低于70%。特别值得注意的是，1,632个被三种方法共同鉴定的潜在ARGs中，91.12%被归类为潜在甲氧苄啶耐药二氢叶酸还原酶（dfr）基因。

生活方式预测分析显示，9419个潜在ARGs由3,394个裂解性噬菌体编码，占所有裂解性噬菌体的18.64%。进一步分析发现，dfr和thyA（胸苷酸合酶）基因在裂解性噬菌体中显著富集，比例分别比温和噬菌体高13倍和10倍。对1,953个裂解性噬菌体携带的潜在dfrA基因进行系统发育分析表明，这些基因与已报道的细菌dfrA基因一致性低于50%，且主要分为A、B两个进化枝。

功能验证实验中，研究人员随机选择19个来自不同进化枝的潜在dfrA基因，在大肠杆菌中表达后发现89.47%（17/19）的基因能赋予甲氧苄啶耐药性。为探究这些基因的传播风险，研究人员使用严格标准（BLASTn一致性>90%，查询长度>90%）在细菌基因组数据库中搜索同源序列，结果仅发现一个潜在dfrA基因与细菌质粒存在高度同源性。移动遗传元件分析显示，仅三个潜在dfrA基因与转座酶同源基因共定位，且其中只有一个转座酶独立发生了水平基因转移，而相邻的潜在dfrA基因并未传播。

研究人员选择携带功能性dfrA52基因的大肠杆菌裂解性噬菌体vB_EcoM_BMB16进行深入研究。RT-PCR和qRT-PCR分析证实dfrA52基因在感染过程中被转录。通过CRISPR-Cas9系统构建dfrA52敲除突变体（ΔdfrA_vB_EcoM_BMB16）后发现，在无甲氧苄啶条件下，野生型和突变型噬菌体的繁殖能力无显著差异；但在甲氧苄啶存在下，ΔdfrA_vB_EcoM_BMB16的繁殖受到显著抑制，而vB_EcoM_BMB16的繁殖能力明显增强。

有趣的是，研究还发现dfrA52基因的表达不仅能增强噬菌体在甲氧苄啶压力下的繁殖，还能促进宿主细菌的生长。ΔdfrA_vB_EcoM_BMB16表现出更强的抗菌活性，而dfrA52的异源表达缩短了细菌生长的延滞期，增加了对数生长期的菌落形成单位（CFUs）。在低细菌密度条件下，ΔdfrA_vB_EcoM_BMB16噬菌体显著抑制细菌生长，而感染vB_EcoM_BMB16的细菌群体在感染后12小时迅速恢复生长。

在芽孢杆菌裂解性噬菌体vB_BtM_BMBsp2中进行的类似实验也观察到一致现象：dfrA53基因的缺失增强了噬菌体的抗菌活性，而该基因的表达促进了宿主细菌的生长和存活。

关键技术方法包括：采用宽松阈值搜索策略（BLASTp E值≤1×10^?5，查询覆盖度≥60%；HMMScan E值≤1×10^?5，得分≥40）结合机器学习结构相似性分析（PCM）鉴定潜在ARGs；使用PhaTRY和BACPHLIP预测噬菌体生活方式；通过CRISPR-Cas9系统构建基因敲除突变体；利用HPLC-MS分析酶活性和药物代谢；采用qRT-PCR进行绝对定量分析。

研究结果部分显示：

Phages carry abundant potential ARGs：通过三种方法鉴定出11,665个潜在ARGs，其中98.63%与已知ARGs一致性低于70%，dfr基因显著富集。

Functional dfrA genes are enriched in lytic phages：裂解性噬菌体中dfr和thyA基因比例显著高于温和噬菌体，19个随机选择的dfrA基因中17个具有功能。

Limited spread of lytic phage-borne dfrA genes：严格标准下仅发现一个dfrA基因可能传播至细菌，移动遗传元件相邻分析显示传播风险有限。

Lytic phage-borne dfrA genes facilitate phage reproduction in the presence of trimethoprim：dfrA52基因增强噬菌体在甲氧苄啶下的繁殖能力，并能辅助其他无dfrA噬菌体的繁殖。

The dfrA gene carried by lytic phage also enhances host bacteria growth under phage infection：dfrA基因表达缓解噬菌体感染对宿主生长的抑制，表现为细菌存活率提高和生长加速。

研究结论表明，裂解性噬菌体可作为dfrA基因的储存库，打破了裂解性噬菌体很少携带功能性ARGs的传统认知。这些基因不仅能在抗生素压力下增强噬菌体繁殖，还能通过促进宿主细菌生长来缓解感染压力，反映了裂解性噬菌体与宿主间的进化互惠关系。与温和噬菌体相比，裂解性噬菌体携带的潜在ARGs传播风险较低（仅0.46%检测到传播），这拓宽了噬菌体治疗中选择噬菌体的标准。该研究为理解抗生素耐药性的进化起源和传播机制提供了新视角，对制定针对耐药性传播的防控策略具有重要指导意义。

论文讨论部分强调，裂解性噬菌体编码的dfrA基因与细菌dfrA基因可能独立进化，其主要选择驱动力是提高宿主适应性。与温和噬菌体5.30%的潜在ARGs相邻移动遗传元件相比，裂解性噬菌体仅0.14%的潜在ARGs与移动遗传元件相邻，进一步支持其低传播风险。这些发现不仅深化了对噬菌体-细菌相互作用的理解，也为开发新型抗菌策略提供了理论基础。