TPGS强化植物源脂质纳米颗粒实现口服精准表观基因组编辑治疗结肠疾病

　　本研究针对CRISPR-Cas9口服给药的挑战，开发了TPGS强化的桑叶脂质纳米颗粒(TPGS-RNP@LNPs)用于靶向递送Lsd1核糖核蛋白(RNPs)。该平台显著增强胃肠道稳定性及结肠黏液穿透能力，在巨噬细胞中实现59.7%的Lsd1编辑效率，通过调控H3K4甲基化水平有效缓解结肠炎症并抑制肿瘤发生，为结直肠疾病提供了创新性治疗策略。

　　

溃疡性结肠炎(UC)及其相关结直肠癌(CAC)的临床治疗面临巨大挑战，现有疗法多为姑息性治疗，缺乏有效的靶向治疗方案。CRISPR-Cas9基因组编辑技术虽然为炎症性疾病、遗传性疾病和各种癌症提供了精确且多功能的治疗策略，但其临床应用仍受到体内递送效率低下的限制。在现有递送形式中，Cas9核糖核蛋白(RNP)复合物相较于质粒DNA和mRNA方法具有明显优势，包括更高的编辑效率、更低的免疫原性和更少的脱靶效应。然而，RNPs的快速降解和较差的细胞摄取能力凸显了对优化递送系统的迫切需求。

近日发表在《SCIENCE ADVANCES》的研究报道了一种创新性口服基因组编辑平台TPGS-RNP@LNPs，该平台将靶向Lsd1的核糖核蛋白封装在桑叶脂质纳米颗粒中，并与d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)共同配制。TPGS增强了LNPs的脂质双层结构，提高了胃肠道稳定性，并促进了结肠黏液渗透。通过巨噬细胞的半乳糖受体介导的内吞作用，TPGS-RNP@LNPs与内体膜融合，并借助核定位信号(NLSs)确保RNPs的核递送。

研究采用的主要技术方法包括：分子动力学模拟分析TPGS与脂质纳米颗粒的相互作用机制；体外细胞实验评估纳米颗粒的内吞作用和基因编辑效率；建立DSS诱导的溃疡性结肠炎和AOM/DSS诱导的结肠癌小鼠模型进行体内疗效评价；使用免疫荧光染色、Western blot、转录组测序等技术分析治疗效果和机制；通过T7E1 assay和T-A克隆测序验证基因编辑效率。人类结肠组织样本来自南昌大学第一附属医院经伦理委员会批准。

Construction and physicochemical characterization of TPGS-RNP@LNPs

研究人员通过免疫荧光染色发现UC和CAC患者结肠组织中LSD1表达显著上调。通过分子动力学模拟发现TPGS的加入使脂质纳米颗粒平衡时间缩短36 ns，结构紧密性显著提高。TPGS-RNP@LNPs粒径为253.7 nm，zeta电位为-38.0 mV，在胃肠道环境中表现出优异的稳定性，远超商业试剂CRISPRMAX和Lipo6000。

Lsd1 knockout–mediated epigenetic alterations restore the damaged colonic epithelial barrier and mitigate inflammatory responses

研究发现TPGS-RNP@LNPs通过半乳糖受体介导的内吞作用被巨噬细胞高效摄取(96.1%)，并通过膜融合机制实现内体逃逸。Npc1表达水平提高2.0倍，而Lamp1和Lamp2表达不变，表明内体结构完整性未受破坏。TPGS-RNP@LNPs在巨噬细胞中实现59.7%的Lsd1编辑效率，显著提高H3K4单甲基化和二甲基化水平，下调促炎因子TNF-α表达，上调抗炎因子IL-10分泌。

TPGS-RNP@LNPs penetrate the mucus layer and accumulate in the colitis-associated lesions

TPGS的加入使纳米颗粒在黏液中的穿透深度提高2.0倍，运动性能显著改善。体内分布显示TPGS-RNP@LNPs在结肠组织中特异性积累，炎症组织和肿瘤组织中的积累量分别是健康组织的67.0倍和169.9倍，且主要被巨噬细胞摄取。

TPGS-RNP@LNPs targeting Lsd1 retard the progression of UC

在DSS诱导的UC模型中，TPGS-RNP@LNPs治疗有效防止体重下降(7.6% vs 11.1%)，恢复结肠长度(7.3 cm)和脾系数(4.8 mg/g)。组织学分析显示治疗组炎症细胞浸润减少，结肠黏膜损伤修复，紧密连接蛋白ZO-1和黏液蛋白MUC2表达恢复正常。同时显著降低CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞水平，提高Foxp3⁺T_reg细胞数量。

TPGS-RNP@LNPs exert a therapeutic effect against UC

在慢性UC治疗中，TPGS-RNP@LNPs显示出显著的治疗效果，结肠隐窝结构更加完整有序，溃疡面积减少，上皮屏障功能得到有效恢复。

TPGS-RNP@LNPs attenuate the progression of CAC

在AOM/DSS诱导的CAC模型中，TPGS-RNP@LNPs治疗组肿瘤数量显著减少，肿瘤体积更小，结肠组织炎症迹象最轻，肿瘤细胞最少，ZO-1表达水平最高。

研究表明，TPGS强化的植物源脂质纳米颗粒平台成功解决了CRISPR-Cas9 RNP口服递送的难题，通过增强胃肠道稳定性、改善黏液穿透能力和实现巨噬细胞靶向递送，实现了高效的Lsd1基因编辑。该研究不仅证实了Lsd1在结肠炎症和肿瘤发生中的关键作用，还展示了一种通过表观遗传调控治疗结肠疾病的新策略。分子动力学模拟揭示的TPGS稳定机制和膜融合介导的内体逃逸机制为纳米药物设计提供了新思路。值得注意的是，该平台在肝脏等非靶器官中未检测到脱靶效应，显示出良好的安全性。虽然目前研究仅在 murine 模型中验证，但这一模块化RNP递送策略为肠道炎症相关疾病的细胞特异性基因工程治疗提供了有价值的技术指导，具有重要的临床转化潜力。未来研究需要进一步在大型动物模型中验证其安全性和有效性，并探索其在其他胃肠道疾病中的应用价值。