光敏骨架酰胺连接子助力固相合成环肽及C端硫酯的创新策略

　　本刊推荐：为解决酸敏感功能基团在环肽和C端修饰肽合成中的局限性，研究人员开发了新型光敏骨架酰胺连接子Hcnb。该连接子通过光化学切割实现肽树脂解离，避免了酸解条件带来的问题，成功合成了高纯度环肽和硫酯，为肽类 therapeutics 提供了更高效的合成工具。

　　

在生物医药领域，环肽和C端修饰肽因其优异的蛋白酶稳定性、膜渗透性以及构象刚性而成为治疗剂开发的热点。然而，传统的固相肽合成（SPPS）方法面临着一个关键挑战：酸解离条件会破坏酸敏感功能基团，限制了含有特殊修饰的肽类分子的合成。特别是在环肽的合成过程中，线性前体从树脂上解离后的溶液环化步骤常常伴随溶解性差、寡聚化和C端差向异构化等问题。为了克服这些难题，科学家们一直致力于开发新型连接策略，能够在树脂上直接实现环化和C端修饰，从而避免后处理步骤中的诸多不便。

早在1998年，Albericio和Barany提出了骨架酰胺连接子（BAL）策略，通过肽链内部酰胺氮原子将生长中的肽锚定在树脂上，从而解放N端和C端进行修饰。这一策略为环肽和C端修饰肽的合成提供了新思路，但传统的BAL连接子依赖于酸解条件，仍然无法完全避免酸敏感基团的破坏。因此，开发一种能够通过非酸解条件实现肽树脂解离的新型连接子成为当务之急。光化学切割技术因其条件温和、正交性好而进入研究视野，但已有的光敏连接子在效率和适用性方面存在明显不足。

在这项发表于《International Journal of Peptide Research and Therapeutics》的研究中，Purdue大学的Mark A. Lipton团队系统评估了多种光敏基团，最终开发出新型2-羟基-4-羧基-6-硝基苄基（Hcnb）连接子，成功实现了环肽和肽硫酯的高效合成。

研究人员首先对五种光敏基团（p-氧苯酰基Op、α-甲基-p-氧苯酰基Mop、p-氧苯偶姻Obz、α,ω-二甲基苯酰Dmp和6-硝基藜芦基Nve）进行了系统评估。通过模型二肽Boc-Phe-Gly-OMe的合成与光解实验，发现Dmp和Nve基团表现出最佳的光解效率。然而，当尝试连接空间位阻较大的氨基酸时，这些基团的胺化与酰化效率显著下降。

基于这一发现，团队创新性地将Sheppard的Hmb辅助基和Smythe的Hnb辅助基中的转酰基化理念引入到邻硝基苄基骨架中，设计了Hcnb连接子。该连接子的独特之处在于其邻羟基能够通过酯化-转酰基化机制促进大位阻氨基酸的酰化，而对位羧基则提供了与树脂连接的锚点，同时增强了光解反应的电子效应。

关键实验方法包括：1）通过钌催化氧化裂解和区域选择性亲核取代合成Hcna醛前体；2）采用还原胺化策略将首个氨基酸锚定至连接子；3）利用对称酸酐实现高效酰化；4）通过三异丙基硅基（TIPS）保护酚羟基抑制二酮哌嗪（DKP）形成；5）使用PyAOP试剂进行树脂上头尾环化；6）采用365 nm紫外光照实现最终产物的光化学切割。

Synthesis of linker-anchored Dipeptides

通过系统比较五种光敏连接子的性能，研究人员发现Nve和Dmp连接子虽然光解效率良好，但对大位阻氨基酸的负载率不足50%。而Hcnb连接子通过其独特的转酰基化机制，成功将模型二肽的酰化产率提升至85%以上，光解效率达90%。

Development of the second-generation Photolabile Linker

Hcnb连接子的设计巧妙融合了邻硝基苄基的光敏特性与邻羟基的转酰基化功能。理论分析表明，邻羟基可通过形成酯中间体促进O→N酰基转移，有效克服空间位阻效应。

Synthesis of Hcna Linker

从商业可得的4-甲基-3,5-二硝基苯甲酸出发，经过四步反应以总收率38%合成Hcna醛关键中间体。其中RuCl₃催化的氧化裂解和醛肟介导的芳香亲核取代是关键步骤。

Solution-phase Synthesis of the Dipeptides Using Hcnb

在溶液相中，Hcnb连接子成功合成了三种不同位阻程度的二肽（Boc-Val-Gly-OMe、Boc-Phe-Leu-OMe和Cbz-Lys-Leu-OMe），证实了其对各种氨基酸的兼容性。

Preparation of the resin-bound Hcnb Linker

将Hcnb连接子通过6-氨基己酸（Ahx）间隔基和脯氨酸接头锚定至TentaGel树脂，建立了固相合成平台。脯氨酸的引入有效抑制了胺醛缩合副反应。

Loading the Dipeptide by Reductive Amination Followed by Acylation

采用酸性条件下的还原胺化策略，实现了首氨基酸的定量负载。对称酸酐酰化策略使二肽形成效率达95%以上。

Loading of the Third Amino Acid

通过TIPS-OTf保护酚羟基，将二酮哌嗪（DKP）副产物从>90%抑制至<12%。针对Ala-Ala等敏感序列，开发了Fmoc半循环策略，通过C端延伸完全避免DKP形成。

The Choice of Model Cyclic Peptides

选择生长抑素类似物环[(D)-Trp-Lys-Gly-(β)-Ala-Phe]（28）、阿尔贝里西奥报道的环十肽（29）和向日葵胰蛋白酶抑制剂（30）作为模型化合物。其中14肽向日葵抑制剂以90%纯度和80%收率完成合成，证明了该方法对复杂环肽的适用性。

Synthesis of C-terminal Thioesters

采用HATU活化/硫酚解策略，成功合成了五种不同C端氨基酸的肽硫酯。空间位阻较小的氨基酸（如甘氨酸）转化率>95%，而缬氨酸等β-分支氨基酸因不利于天然化学连接（NCL）反应，转化率较低（~30%）。

该研究开发的Hcnb连接子代表了光敏BAL技术的重大突破。其创新性体现在：1）首次将转酰基化机制引入光敏连接子设计；2）通过可逆的TIPS保护策略解决DKP形成难题；3）兼容酸/碱/钯催化等多种反应条件。该方法为合成含有酸敏感修饰（如糖基化、磷酸化）的肽类分子提供了新途径，有望推动靶向蛋白-蛋白相互作用的新型治疗剂开发。未来可进一步探索该连接子在寡聚脲等肽模拟物合成中的应用，拓展其在新药研发中的价值。