新型急慢性脓肿分枝杆菌感染小鼠模型的建立及其在抗菌药物筛选中的应用与评价

　　本综述系统评价了15种不同免疫背景的小鼠品系对脓肿分枝杆菌（MAB）肺部感染的应答特征，鉴定出GM-CSF KO、NRG、NSG及SCID-Beige四种可建立持续性感染（>28天）的模型，并验证其在抗菌药物（如TGC、IMP、CLR、AMK、BDQ）药效评价中的应用价值，为抗MAB药物研发提供了关键临床前模型工具。

　　

引言

脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus, MAB）是一种快速生长的非结核分枝杆菌（NTM），近年来已成为影响人类健康的重要病原体，尤其对囊性纤维化（CF）、非CF支气管扩张及免疫系统受损患者造成严重威胁。由于MAB对多数抗生素（包括抗结核药物）具有固有及获得性耐药性，其肺部感染的治疗极为困难。当前治疗方案需长期（12–24个月）联合使用多种口服及肠外抗生素，不仅毒性显著，且治愈率低于50%，复发率高。因此，开发新型有效药物已成为迫切需求。临床前研究亟需能够模拟MAB进行性及持续性肺部感染的可靠动物模型，而常用小鼠品系多能清除MAB感染，限制了药物筛选进程。

材料与方法

研究使用MAB ATCC 19977光滑形态菌株，通过三种途径感染小鼠：Glas-Col吸入气溶胶装置（靶向肺部沉积~10⁴ CFU）、PennCentury气管内喷雾（靶向~10⁴ CFU）及静脉注射（IV，靶向~10⁶ CFU）。感染后不同时间点（0、2、10、28、56、90天）采集肺、肝、脾组织，匀浆后涂布于含碳青霉烯和环己酰亚胺的Middlebrook 7H11琼脂平板，培养3–5天后计数菌落形成单位（CFU）。组织病理学分析采用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片，行苏木精-伊红（H&E）及齐尔-尼尔森（Ziehl-Neelsen）染色，使用QuPath软件进行病变量化。

结果

非清除型MAB小鼠模型

通过气溶胶感染，研究鉴定出三种可建立慢性（>28天）肺部MAB感染的小鼠品系：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子敲除（GM-CSF KO）、NOD.Rag.IL2Rγ链缺陷（NRG）及NOD.SCID.IL2Rγ链缺陷（NSG）小鼠。这些模型在感染后2–10天肺内细菌负荷呈稳定或增长趋势（>10³ CFU），并伴随细菌向肝脾播散。

GM-CSF KO小鼠感染后10天内肺内细菌增长10,000倍，随后至28天快速下降，28–56天进入平台期（~10³ CFU）。肝脾菌载量变化趋势类似，峰值出现在第10天（~10⁴ CFU）。NRG与NSG小鼠肺内菌载缓慢稳定增长，至90天仍维持10⁴–10⁵ CFU，且NRG组个体差异小于NSG。SCID-Beige小鼠经IV感染后，90%细菌定植于肝脏，肺内仅占1%，菌载波动小但持续存在。

组织病理显示，GM-CSF KO小鼠早期（10天）炎症显著，表现为肺实质增厚、肉芽肿形成（含泡沫样巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞），抗酸染色阳性菌（AFB）多见于巨噬细胞内，部分位于肺泡腔。慢性期（28–56天）炎症减轻，肉芽肿缩小。NRG、NSG及SCID-Beige小鼠慢性感染期可见肺实质增厚及巨噬细胞聚集，AFB主要位于细胞内。

清除型MAB小鼠模型

包括免疫健全小鼠（C57BL/6、BALB/c）、囊性纤维化跨膜传导调节因子缺陷（CFTR）、一氧化氮合酶2敲除（NOS-2 KO）、溶酶体贮积症（NPC1、Hurler）、结缔组织病（Marfan）及免疫缺陷品系（NUDE、NOD、NOD-RAG、NOD-SCID）。尽管这些品系存在免疫、代谢或结构异常，但均能有效清除MAB感染，肺内菌载在2–10天快速下降，28天时多数降至检测限以下，且肺外播散有限。

感染方法比较

在GM-CSF KO小鼠中，Glas-Col吸入与气管内喷雾两种气溶胶感染方法在各时间点肺、肝、脾菌载无显著差异（除第10天肝脏外），均能实现持续感染（≥10³ CFU）。感染进程可分为三期：Ⅰ期（急性期，0–10天），菌载对数增长；Ⅱ期（早期慢性期，10–28天），菌载快速下降；Ⅲ期（慢性期，28–90天），菌载稳定。

药物筛选验证

在急性（感染后2天开始治疗）及慢性（感染后28或56天开始治疗）模型中评价了替加环素（TGC，50 mg/kg）、亚胺培南（IMP，100 mg/kg）、克拉霉素（CLR，250 mg/kg）、阿米卡星（AMK，150 mg/kg）及贝达喹啉（BDQ，25 mg/kg）的单药疗效。

TGC在急慢性模型中均高度有效，在NRG慢性感染模型中使肺、肝、脾菌载分别降低2.8、1.5、1.1 log₁₀ CFU（P < 0.01–0.0001），在GM-CSF KO急性模型中降低4.5 log₁₀ CFU（P < 0.0001）。IMP在NRG及GM-CSF KO慢性模型中分别降低肺菌载0.9 log₁₀（P < 0.01）及3.1 log₁₀ CFU（P < 0.0001）。CLR与AMK仅在GM-CSF KO急性模型中有显著效果（肺菌载降低1.1及1.8 log₁₀ CFU，P < 0.0001），慢性模型中无效。BDQ除在SCID-Beige急性感染肝脾中有一定效果外，多数情况下无效。

讨论

本研究系统评价了15种小鼠品系对MAB感染的应答，鉴定出四种可持续感染模型（GM-CSF KO、NRG、NSG、SCID-Beige），其中GM-CSF KO模型感染进程再现了急性增长、早期下降及慢性持续三阶段，且病理变化与人类疾病有相似之处（泡沫样巨噬细胞浸润、肉芽肿形成）。多数测试品系（包括CFTR、NOS-2 KO、Marfan、Hurler、NPC1等）虽模拟了人类MAB易感因素（气道一氧化氮减少、解剖异常、溶酶体功能障碍），却均能清除感染，提示MAB发病机制 multifactorial，单一基因缺陷难以完全模拟人类疾病。

药物筛选结果表明，TGC与IMP在急慢性模型中均有效，而临床常用药物CLR与AMK仅急性有效，可能与被试菌生理状态（活跃复制vs休眠）、组织病理影响PK/PD参数或MAB耐药机制（如erm(41)介导的大环内酯耐药、药物外排泵）有关。尽管TGC疗效显著，其临床应用受限于安全性警告及耐受性问题，吸入给药或为改善策略。

研究局限性包括仅使用MAB ATCC 19977光滑型，未探索其他菌株或形态；GM-CSF KO、NSG、NRG小鼠商业供应有限；IV感染易致内耳/脑部并发症，不推荐采用。未来工作将聚焦联合疗法评价，以优化疗效、降低毒性及耐药风险。

综上，本研究为抗MAB药物研发提供了关键临床前模型，深化了对宿主-MAB互作的理解，并为治疗策略优化提供了实验依据。