新型含氮二苯并呋喃衍生物C156-P1通过抑制内体酸化展现广谱抗黄病毒科活性

　　本研究揭示含氮二苯并呋喃衍生物C156-P1作为 vacuolar-type ATPase (V-ATPase) 抑制剂，通过靶向 ATP6V0A2 亚基抑制内体酸化，有效阻断登革病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKV)等黄病毒科病毒的膜融合过程，在体外和AG129小鼠模型中均展现纳摩尔级抗病毒活性（EC50 < 6 nM），为开发宿主靶向广谱抗病毒药物提供了新策略。

　　

ABSTRACT

登革病毒（DENV）是严重的公共卫生威胁，四种血清型每年导致约9600万有症状感染。目前尚无针对DENV感染的特异性抗病毒药物。本研究通过筛选12种二苯并呋喃衍生物，发现含氮化合物C156-P1对DENV感染具有强效抑制作用。该化合物对黄病毒科病毒展现出广谱抗病毒活性，包括四种DENV血清型（DENV-1至DENV-4）、寨卡病毒（ZIKV）、日本脑炎病毒（JEV）、黄热病毒（YFV）和丙型肝炎病毒（HCV），同时还能抑制1型单纯疱疹病毒（HSV-1）和水疱性口炎病毒（VSV）感染，但对腺病毒和仙台病毒无效。

机制研究表明，C156-P1在病毒进入细胞后、内体膜融合前阶段抑制DENV-2感染。它通过干扰ATP6V0A2亚基表达抑制 vacuolar-type ATP酶（V-ATP酶）活性，从而抑制内体酸化。这导致病毒被限制在晚期内体中，无法与内体膜融合，最终抑制感染。C156-P1处理还能抑制DENV-2感染诱导的I型干扰素（IFN-I）反应和内体Toll样受体3（TLR3）激活。在AG129小鼠模型中，C156-P1显著降低DENV-2感染并提高存活率。

INTRODUCTION

登革病毒属于黄病毒科正黄病毒属，该科还包括ZIKV、JEV、西尼罗病毒（WNV）和YFV等重要病原体。DENV感染导致从自限性登革热到严重登革（表现为出血和毛细血管渗漏的潜在致死性疾病）的多种疾病谱。四种DENV血清型通过伊蚊媒介在人类中维持传播循环，在129个国家引发流行，每年导致约3.9亿感染，其中约9600万有症状病例和估计1万死亡病例。登革被世界卫生组织列为2019年全球健康十大威胁之一。目前尚无批准用于治疗DENV感染的抗病毒药物。

DENV是一种包膜病毒，具有约10.7kb的单链正链RNA基因组，包含一个开放阅读框（ORF），两侧为结构化的5′和3′非翻译区。ORF翻译成多蛋白，经细胞和病毒蛋白酶切割产生三种结构蛋白（衣壳蛋白C、前膜蛋白prM和包膜蛋白E）和七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。结构蛋白构成病毒颗粒并对细胞进入至关重要，非结构蛋白主要促进病毒基因组复制和翻译，以及与病毒生命周期必需的宿主因子相互作用。DENV通过网格蛋白依赖的受体介导的内吞作用进入宿主细胞。内化病毒颗粒经历低pH依赖的病毒和内体膜融合，将病毒RNA释放到细胞质中，随后在内质网（ER）翻译并在内陷膜囊泡中复制。病毒RNA与C蛋白结合后形成核衣壳，与prM和E蛋白包被后出芽进入ER腔，形成未成熟病毒颗粒。这些颗粒通过高尔基体运输到反式高尔基网络，经弗林蛋白酶切割prM成熟后释放。靶向病毒生命周期的不同阶段是药物开发的基本策略。黄病毒相似的生命周期增强了开发广谱抗黄病毒药物的潜力。

许多具有治疗活性的化合物源自天然产物，主要来自植物。先前我们从传统中药植物小驳骨（Justicia gendarussa）中鉴定出二苯并呋喃（DP），一种芳基萘木脂素（ANL）。DP被确定为强效V-ATP酶抑制剂，抑制溶酶体酸化。研究证据支持DP对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）、1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、流感病毒和裂谷热病毒（RVFV）具有广谱抗病毒活性。此外，DP还表现出抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗菌等多种生物活性。然而，DP水溶性低和抗病毒活性不足限制了其作为抗病毒治疗剂的进一步发展，突显了结构修饰的迫切需求。最近研究表明，含氮二苯并呋喃衍生物比DP具有更强的抗埃博拉病毒活性。我们最近的研究表明，含氮DP衍生物通常对DENV-3复制子和DENV-1-4感染提供优异的抑制活性。然而，这些发现需要使用真实病毒进一步验证，且其抗病毒活性的分子机制仍有待阐明。

在本研究中，我们使用真实病毒感染试验评估了12种DP衍生物的抗DENV活性。其中，含氮DP衍生物C156-P1被鉴定出并在体外和体内对DENV-1-4感染表现出强效抗病毒活性。此外，C156-P1对黄病毒科病毒（包括ZIKV、JEV、YFV和HCV）以及其他包膜病毒如HSV-1和VSV表现出抗病毒功效。机制研究表明，C156-P1通过靶向V-ATP酶的ATP6V0A2亚基抑制内体酸化来抑制病毒感染。

RESULTS

The DP derivative C156-P1 efficiently inhibited DENV-2 infection in vitro

天然化合物DP和patentiflorin A（PTA，也称为6-脱氧葡萄糖-二苯并呋喃）是从药用植物小驳骨中分离的ANL先导分子，作为广谱抗病毒剂显示出前景。我们最近使用DENV-3复制子筛选了83种化学合成的ANL衍生物库，发现含氮ANLs（N-ANLs）表现出最高的抗病毒效力。我们选择了12种对DENV-3复制子具有显著抑制作用的ANL衍生物，并评估了它们对真实DENV-2株16681的抗病毒活性。结果显示，DP衍生物（C176-P1和C180A-P1）、含氮DP衍生物（C156-P1、C165-P1、C169-P1和C201-P1）和含氮PTA衍生物（C45-P1、C58-P1、C59-P1和C70-P1）对DENV-2的50%有效浓度（EC₅₀值）低于其母体化合物（DP或PTA）。然而，与母体化合物相比，DP和PTA的含氮衍生物在A549细胞中也表现出较低的50%细胞毒性浓度（CC₅₀）。有趣的是，含氮DP衍生物C156-P1对DENV-2显示出最低的EC₅₀值（1.36 nM）和最高的选择性指数（SI = 292.65）值。C156-P1的化学结构显示，其他化合物的化学结构见图S1。总之，C156-P1被确定为测试的ANL衍生物中最有前景的抗病毒化合物，并在本研究中进一步探索。

C156-P1 inhibited the infection of four serotypes of DENV (DENV-1–4) in different cell lines

随后，我们评估了C156-P1在不同细胞系中对DENV-2的抗病毒功效。我们发现C156-P1在Vero、人脐静脉内皮细胞系（HUVEC）和Huh7细胞中抑制DENV-2感染，EC₅₀ <5 nM且SI> 100。在Vero、A549、HUVEC和Huh7细胞中，DENV-2 NS3蛋白水平随着C156-P1浓度增加而降低。使用50 nM C156-P1（在HUVEC细胞中细胞毒性<62.5 nM）进行后续实验。我们感染A549细胞与DENV-2株16681，观察到在12、24、36和48小时感染后（hpi），与DMSO处理组相比，C156-P1处理组的病毒RNA水平和NS3蛋白下调。同时，在24、36和48 hpi时，C156-P1处理显著降低了病毒滴度。在DENV-2感染的HUVEC和Huh7细胞中也观察到类似的抑制效果。免疫荧光染色还显示，C156-P1处理后DENV-2 NS3阳性A549细胞数量显著减少。此外，C156-P1有效抑制A549和Vero细胞中DENV-1、DENV-3和DENV-4的感染，EC₅₀值范围从4.84到8.38 nM。总之，这些结果表明C156-P1在多种培养细胞系中以剂量依赖性方式强力抑制DENV感染。

C156-P1 inhibited the infections of ZIKV, JEV, YFV, and HCV in vitro

为确定C156-P1是否能抑制黄病毒科其他病毒，我们检测了C156-P1对ZIKV（SZ01株）、JEV（SA14-14-2株）、YFV（17D株）和HCV（JFH1株）的抗病毒效果。在Vero和A549细胞中，C156-P1剂量依赖性地抑制ZIKV、JEV和YFV感染，通过空斑试验测定所有三种病毒的EC₅₀ <6 nM。一致地，在Vero和A549细胞中，ZIKV NS3、JEV E和YFV E蛋白水平随着C156-P1浓度增加而降低。与对DENV-2的效果相似，C156-P1显著抑制ZIKV、JEV和YFV感染，证据是A549细胞在12、24、36和48 hpi时病毒RNA、蛋白水平和感染性病毒滴度降低。此外，我们评估了C156-P1对Huh7细胞中HCV的抗病毒活性，发现它以剂量依赖性方式显著抑制HCV感染，EC₅₀值为5.13 nM。这些结果表明C156-P1对黄病毒科多种病毒表现出广谱抗病毒活性。

C156-P1 inhibited the infection of enveloped viruses via endocytosis entry

为确定C156-P1是否能抑制黄病毒科以外的其他病毒，我们测试了其对疱疹病毒科、弹状病毒科、腺病毒科和副粘病毒科病毒的效力。首先，我们评估了C156-P1对A549细胞中HSV-1-eGFP和VSV-eGFP的抑制效力，发现随着C156-P1处理，释放到上清液中的病毒滴度以剂量依赖性方式降低，通过空斑试验测定HSV-1-eGFP病毒的EC₅₀值为6.21 nM，VSV-eGFP病毒为9.27 nM。eGFP水平和eGFP阳性细胞数量进一步证实了病毒滴度的降低。接下来，我们测试了C156-P1是否对腺病毒（AdV）显示出抑制效果。我们感染A549细胞与Ad5-eGFP病毒，发现DMSO处理和C156-P1处理培养物之间的Ad5-eGFP阳性细胞数量无显著差异。令人惊讶的是，C156-P1处理后细胞内的平均荧光强度（MFI）略微增加，eGFP表达水平和病毒hexon mRNA也增加。最后，我们通过测定病毒核衣壳蛋白（NP）基因mRNA表达水平（SeV无报告基因）测试C156-P1是否抑制SeV感染。与Ad5-eGFP病毒相似，C156-P1不抑制SeV感染，且病毒NP mRNA水平以C156-P1浓度依赖性方式略微增加。总之，这些结果表明C156-P1对几种黄病毒科病毒（DENV、ZIKV、JEV、YFV和HCV）以及HSV-1和VSV具有广谱抗病毒活性，但不抑制AdV和SeV感染。

我们假设这可能与不同病毒进入宿主细胞的途径有关。HSV-1和VSV都是包膜病毒，利用与黄病毒科病毒相似的细胞进入途径，涉及内吞作用和pH依赖的融合。相比之下，AdV是一种无包膜病毒，通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞。与黄病毒科病毒不同，AdV部分衣壳在内体中解包释放蛋白VI，后者破裂内体膜，允许部分分解的病毒颗粒进入细胞质。SeV是一种包膜病毒，通过直接与细胞膜融合进入宿主细胞。我们先前的研究表明，DP可以通过抑制内体酸化来阻止病毒膜与内体膜融合及后续感染。总之，我们推测含氮DP衍生物C156-P1可能抑制通过内吞作用和pH依赖方式进入宿主细胞的病毒感染。

C156-P1 inhibited flavivirus infection at the early stages after cell entry

为确定C156-P1可能靶向病毒生命周期的哪一步骤，我们进行了药物添加时间试验。在黄病毒感染期间，将C156-P1施用于A549细胞， either at the virus entry (before and co-incubation) or post-entry (after) stage。平行包括溶剂DMSO处理的对照组。在48 hpi收获每组细胞和上清液用于后续分析。在DENV-2感染实验中，与DMSO对照组相比， before-、 during-和 after-incubation组均表现出细胞内病毒RNA、病毒NS3蛋白和细胞外感染性病毒滴度水平显著降低。在三个处理组中， co-incubation组显示病毒RNA和感染滴度水平最低，其次是 before-incubation组，然后是 after-incubation组。类似地，在ZIKV或JEV感染中， co-incubation组表现出最低的感染水平。这些结果表明C156-P1在早期阶段抑制黄病毒感染。

接下来，我们测试了C156-P1是否抑制黄病毒进入宿主细胞的早期阶段，包括结合和内化步骤。结果表明C156-P1对DENV-2、ZIKV和JEV感染的内化或结合步骤均未表现出抑制效果。总之，这些结果表明C156-P1在病毒进入细胞后的早期阶段抑制黄病毒感染。

C156-P1 restricted the release of the DENV-2 genome into the cytoplasm from endosomes

DENV感染通过宿主识别细胞质中释放的病毒RNA触发I型干扰素（IFN-I）反应。DENV通过内吞作用进入宿主细胞，其中低pH诱导的E蛋白构象变化促进病毒与内体膜融合，从而将病毒基因组释放到细胞质中。如果DENV在C156-P1抑制下被抑制在融合前阶段，病毒RNA可能不会释放到细胞质中，或只有有限量的病毒RNA会被释放。因此，在存在C156-P1的情况下，DENV感染细胞中的IFN-I反应可能不会被激活或减弱。为此，我们研究了有和没有C156-P1处理下A549细胞中DENV-2感染后的IFN-I反应。结果表明，DENV-2感染在12、24、36和48 hpi时显著增加IFN-I反应，通过升高的IFNB1 mRNA和干扰素刺激基因（ISGs）如IFIT1、ISG15和OAS1的mRNA水平确定。值得注意的是，IFNB1和这些ISGs的水平被C156-P1处理明显抑制。同时，DENV-2感染增加了TANK结合激酶1（TBK1）和IFN调节因子3（IRF3）的磷酸化水平，这种增加也被C156-P1处理抑制。作为对照，单独C156-P1处理，无病毒感染，不改变磷酸化TBK1和IRF3的水平。这些结果表明C156-P1抑制DENV-2感染诱导的IFN-I反应，暗示更少的病毒RNA可能被释放到细胞质中。

Toll样受体3（TLR3）是一种模式识别受体（PRR），主要定位在内体膜上，主要被病毒双链RNA（dsRNA）激活。因此，TLR3激活程度暗示了内体膜上病毒dsRNA的感知。这里，我们研究了DENV-2感染后A549细胞中TLR3表达水平，以及C156-P1处理是否调节DENV相关TLR3表达。结果表明，TLR3 mRNA水平在12、24、36和48 hpi时以时间依赖性方式增加，这与DENV-2基因组复制相关。正如预期，C156-P1处理显著降低TLR3 mRNA表达并废除其时间依赖性模式。这些结果表明C156-P1抑制TLR3激活，暗示dsRNA被限制暴露于内体膜。总之，C156-P1抑制DENV-2感染诱导的IFN-I反应和内体TLR3激活，表明C156-P1处理很大程度上限制DENV从内体释放到细胞质中。

C156-P1 mediated endosomal acidification by targeting ATP6V0A2 subunit of ATPase to restrict DENV residing in endosomes

我们已经证明C156-P1在细胞进入后的早期阶段抑制DENV感染，并降低IFN-I和TLR3的激活水平。这引出了C156-P1减弱或抑制病毒RNA释放到细胞质中的假设。已知DENV进入内体后，内体酸化是DENV E蛋白构象重排的先决条件，为其膜融合和病毒RNA释放做准备。因此，我们假设C156-P1减弱或抑制病毒基因组释放到细胞质中，从而减少DENV感染。

因此，我们研究了C156-P1是否通过阻止内体酸化来抑制DENV-2感染，以及病毒颗粒是否驻留在内体内。首先，我们使用酸敏感指示剂DND-189评估了C156-P1是否影响内体和溶酶体的pH值。使用V-ATP酶抑制剂bafilomycin A1（Baf-A1）作为阳性对照来阻止内体酸化。结果表明，与DMSO模拟处理（紫色）相比，C156-P1（蓝色）和Baf-A1（红色）处理将FITC峰值左移。此外，C156-P1以剂量依赖性方式显著降低FITC的MFI。这些结果表明C156-P1表现出与Baf-A1相似的阻止内体酸化机制。

内化后，DENV颗粒被递送到Rab5阳性早期内体，随后成熟为Rab7阳性晚期内体，在那里病毒-细胞膜融合以低pH依赖方式发生。为进一步确定C156-P1是否限制病毒颗粒驻留在内体内，A549细胞转染mNeonGreen-Rab7A，然后在存在C156-P1（50 nM）下感染DENV-2 12小时（DENV E蛋白在2、4和8 hpi不可检测）。我们的发现显示，C156-P1显著增强DENV E蛋白和Rab7A之间的共定位。这些结果表明C156-P1抑制内体酸化并将DENV颗粒限制在内体内。

接下来，我们试图确定C156-P1诱导DENV内体滞留的机制。先前研究证明DP调节V-ATP酶表达，从而抑制内体酸化。由于C156-P1诱导内体酸化和限制病毒颗粒 inside the endosomes，我们继续研究V-ATP酶是否在此过程中发挥作用。V-ATP酶复合物由32个亚基组成，ATP6V0A2亚基在内体质子运输中起关键作用，这对V-ATP酶功能很重要。因此，我们研究ATP6V0A2是否参与DENV感染及其与C156-P1处理的相关性。我们观察到C156-P1处理A549细胞后ATP6V0A2 mRNA表达减少，与PHY34处理效果相似，后者是一种ATP6V0A2抑制剂。PHY34处理也以剂量依赖性方式抑制内体酸化和DENV-2感染，与C156-P1处理相似。我们进一步检查了C156-P1和PHY34是否影响V-ATP酶活性。结果表明，C156-P1和PHY34与Baf-A1相似，显著降低V-ATP酶活性。此外，C156-P1对V-ATP酶活性的降低是剂量依赖性的。此外，siRNA敲低ATP6V0A2显著降低DENV-2 RNA水平、NS3蛋白表达和感染性病毒滴度。敲低ATP6V0A2亚基也导致细胞内V-ATP酶活性降低。总之，这些结果表明ATP6V0A2亚基是C156-P1的靶点，主要负责阻止内体酸化，从而抑制黄病毒感染。

C156-P1 inhibited DENV-2 infection in mice

为评估C156-P1对DENV感染的治疗效果，我们感染了AG129小鼠（缺乏IFN-α/β和IFN-γ受体）与DENV-2株16681并用C156-P1处理。基于我们先前小鼠中PTA的剂量数据，选择0.2 mg/kg C156-P1用于小鼠实验。我们选择这个剂量是因为C156-P1表现出比PTA更低的EC₅₀值，且C156-P1和PTA都是DP衍生的衍生物。在未接受C156-P1治疗的组中，病毒攻击后第6天观察到100%死亡率。相比之下，C156-P1（0.2 mg/kg）治疗保护小鼠免受此致死剂量挑战，导致直到实验在第15天终止时存活率为60%。与DENV-2组相比，C156-P1治疗减轻了DENV-2感染小鼠的体重下降并增强了行为迹象；存活小鼠从接种后第8天开始从临床症状中恢复，体重逐渐恢复。接种DMEM的对照组小鼠均未表现出任何临床症状或体重减轻。为进一步确认注射后病毒感染，我们测定血液样本（包括血细胞）中的病毒RNA载量，发现C156-P1显著降低小鼠血液中的DENV-2。这些结果表明C156-P1在体内表现出抗DENV感染的治疗潜力。

DISCUSSION

目前尚无用于DENV感染的特异性抗病毒药物，突显了开发登革热有效治疗剂的迫切需求。在本研究中，我们发现含氮DP衍生物C156-P1在体外和体内对DENV-2感染表现出强效抑制作用。此外，C156-P1通过抑制其他DENV血清型（DENV-1、DENV-3和DENV-4）以及其他黄病毒科病毒如ZIKV、JEV、YFV和HCV展示出广谱抗病毒活性。此外，C156-P1还抑制来自其他科的包膜病毒感染，包括HSV-1和VSV。机制研究表明，C156-P1靶向ATP6V0A2亚基，影响V-ATP酶活性并抑制内体酸化。这种抑制机制将病毒颗粒限制在内体内，有效阻断DENV在膜融合过程之前和期间的感染。总之，这些发现突出了C156-P1作为广谱抗病毒剂，特别是抗黄病毒的潜力。

天然化合物DP是一种从小驳骨植物中分离的ANL。DP作为V-ATP酶抑制剂，被认为是有前景的广谱抗病毒候选物。发现该化合物对SARS-CoV-2、流感病毒、蜱传脑炎病毒、WNV、ZIKV、RVFV、狂犬病病毒、HSV-1、基孔肯雅病毒和VSV在低微摩尔浓度下具有活性。尽管DP被认可为广谱抗病毒剂，其有限的水溶性和不足的抗病毒活性显著阻碍其临床适用性。为提高DP的抗病毒活性和生物利用度，已报道各种DP纳米颗粒和结构修饰的衍生物。DP纳米颗粒表现出降低的细胞毒性和增强的抗病毒活性，在流感病毒和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）中得到证实。糖基化DP衍生物，如Justiprocumin B和PTA，已显示增强抗病毒活性，分别在纳摩尔浓度抑制HIV和ZIKV。最近研究发现各种含氮DP衍生物在低纳摩尔浓度阻断埃博拉病毒进入。从12种测试的ANLs中的8种N-ANLs系列中，我们鉴定出C156-P1，它在低纳摩尔浓度（EC₅₀ < 5 nM）有效抑制DENV-2感染，在多种猴和人类细胞系中展示体外抗病毒功效。C156-P1在A549细胞中对DENV-2的抗病毒活性比母体化合物DP高近300倍。值得注意的是，C156-P1在结构上与其他DP衍生物不同，因为它是唯一含有氰基的化合物。这个含氮和三键的氰基位于靠近DP骨架的位置。尽管C70-P1也有一个氰基，但其氰基位于离DP结构核心更远的位置。化合物176-P1具有与C156-P1非常相似的结构，但它只含有一个碳-碳三键，而不是氰基。其余化合物在结构上与C156-P1差异更大。此外，C156-P1在低纳摩尔浓度（EC₅₀ < 10 nM）对DENV-1、DENV-3和DENV-4感染表现出强效抗病毒效果，突出了其强大的抗DENV活性。

近几十年来已鉴定出许多抗黄病毒化合物；然而，由于效力、特异性、毒性和稳定性问题，只有有限数量进入临床前试验。最近研究鉴定出一种强效DENV抑制剂JNJ-1802，它阻断NS3-NS4B相互作用并在小鼠和恒河猴中产生有效的抗DENV感染效果；JNJ-1802已完成首次人体I期临床试验。然而，JNJ-1802缺乏对其他黄病毒科病毒的抑制效果。相比之下，C156-P1是一种广谱抗病毒剂，不仅强力抑制DENV感染，还抑制其他黄病毒科病毒的感染。C156-P1被证明在低纳摩尔浓度（EC₅₀ < 6 nM）在体外有效抑制ZIKV、JEV、YFV和HCV，显著低于细胞毒性浓度。氯喹，一种FDA批准的治疗疟疾药物，可通过抑制内体酸化用于预防ZIKV感染；然而，细胞培养中抑制ZIKV感染所需的抑制浓度在微摩尔范围。抗寄生虫药物氯硝柳胺也能通过抑制内体酸化抑制DENV-2感染，EC₅₀值约为10 μM。除了抑制黄病毒科病毒，C156-P1还能抑制通过内吞作用或低pH依赖融合进入宿主细胞的病毒，如HSV-1和VSV所示。相比之下，C156-P1不抑制SeV，后者不通过内吞途径进入细胞，而是通过直接与宿主细胞膜融合。类似地，C156-P1不抑制AdV，后者通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞，不需要与内体膜融合。这些发现进一步表明C156-P1选择性抑制通过内吞途径进入宿主细胞并经历低pH依赖融合的病毒。

在机制研究中，我们发现C156-P1在病毒进入宿主细胞后的早期阶段抑制黄病毒感染，不影响病毒结合和内化。此外，C156-P1减少了DENV感染诱导的IFN-I反应激活和内体TLR3激活。因此，这些结果表明C156-P1对DENV感染的抑制效果涉及IFN-I激活以外的途径。减弱的IFN-I反应表明DENV RNA的IFN-I激活剂被限制暴露于细胞质中的RNA传感器。最后，我们通过实验证明C156-P1将DENV限制在内体内，显示与Rab7A共定位。鉴于病毒进入细胞后的早期阶段被抑制，我们发现C156-P1靶向病毒包膜与内体膜融合的前阶段或期间。

DP和PTA已被证明以剂量依赖性方式抑制内体和溶酶体酸化。C156-P1是一种含氮DP衍生物，在我们的研究中也展示了抑制内体和溶酶体酸化的能力。DENV-2通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主