靶向Cyp51同工酶的唑类抗真菌药物协同作用研究：开辟真菌感染治疗新策略

　　本研究发现不同唑类抗真菌药物对Cyp51同工酶（Cyp51A和Cyp51B）具有选择性抑制特性，联合使用可产生显著协同效应。该研究为开发针对多重Cyp51同工酶真菌的精准联合疗法提供了理论基础，通过同工酶特异性药物组合策略，有望解决真菌耐药性这一临床难题。

　　

ABSTRACT

病原真菌由于其真核特性导致治疗靶点有限，给社会带来重大挑战。这一局限性凸显了提高对Cyp51抑制剂敏感性的重要性，Cyp51是唑类抗真菌药物靶向的麦角固醇生物合成途径中的关键酶。在主要皮肤癣菌物种红色毛癣菌的Cyp51同工酶缺失菌株中，研究发现Cyp51B对基础菌丝生长至关重要，而Cyp51A则作为与唑类耐受性相关的诱导型同工酶。基于这些不同的功能，研究假设每种同工酶对唑类抗真菌药物会表现出不同的敏感性。研究表明，大多数唑类药物对Δcyp51A菌株的抗真菌活性增强，而部分药物对Δcyp51B菌株的抗真菌活性增强。值得注意的是，氟康唑、硫康唑和抑霉唑对Δcyp51A表现出相对增强的活性，而丙氯唑对Δcyp51B表现出增强的活性。将这些同工酶选择性药物联合使用，对野生型菌株和亲本ku80敲除菌株产生了协同效应，但对单个Cyp51敲除突变体则没有。数据揭示，两种Cyp51同工酶可被不同的唑类抗真菌药物选择性抑制，联合使用时产生协同效应。这种协同效应在另一种同样拥有两个Cyp51同工酶的真菌物种Aspergillus welwitschiae上也得到观察。这些数据证明，将具有不同Cyp51同工酶选择性的唑类抗真菌药物组合使用，可对拥有多个Cyp51同工酶的真菌产生协同效应。这些发现通过证明具有不同Cyp51同工酶选择性的抗真菌药物组合为治疗真菌感染提供了一种有前景的方法，推进了抗真菌治疗策略，为同工酶特异性药物开发开辟了新途径。

INTRODUCTION

真菌感染是一项重大的全球健康挑战，每年导致375.2万人死亡。在非致死性真菌感染中，皮肤癣菌病影响了世界10%以上的人口，通过直接症状（如瘙痒和炎症）显著影响患者的生活质量，并可能加剧哮喘等疾病，增加发生糖尿病足溃疡的风险。由于真菌和哺乳动物细胞组分的相似性，开发选择性抗真菌药物尤其具有挑战性，这迫使人们必须发现新的药物靶点和针对现有分子靶点的新方法。

联合疗法通常使用针对不同分子的药物来发挥叠加或协同效应。然而，研究表明，联合使用同一类药物也可能有效。例如，β-内酰胺类抗生素组合在体外和临床环境中均被报道有效，因为它们以不同的亲和力与多种青霉素结合蛋白相互作用。当两种具有不同PBP偏好的β-内酰胺联合使用时，它们可以在较低浓度下有效抑制多个PBP。这一原理表明，拥有同一靶酶多个同工酶的病原体可能容易受到具有不同同工酶偏好的药物组合的增强抑制。尽管同一类药物组合的协同效应在抗菌治疗中已得到充分研究，但类似的抗真菌药物研究仍然缺乏。

唑类抗真菌药物是使用最广泛的抗真菌药物类别，其靶向麦角固醇生物合成途径中的甾醇14α-去甲基化酶Cyp51。虽然在白色念珠菌和酿酒酵母中Cyp51由单个必需基因编码，但一些丝状真菌，包括毛癣菌属和曲霉属物种，拥有多个cyp51基因。例如，最常见的皮肤癣菌病病原体红色毛癣菌同时表达Cyp51A和Cyp51B。然而，现有唑类抗真菌药物的同工酶特异性活性谱在很大程度上仍未探索。这一关键的知识缺口阻碍了更有效的联合疗法的开发。

研究假设唑类抗真菌药物对Cyp51同工酶表现出不同的选择性，并且具有不同同工酶偏好的唑类药物组合可以通过协同效应提高敏感性。本研究在红色毛癣菌中构建了cyp51A和cyp51B缺失菌株，并证明了各种唑类抗真菌药物的同工酶选择性。研究结果为开发利用病原真菌同工酶特异性漏洞的新型联合疗法奠定了基础。

RESULTS

Characterization of Cyp51 isozyme deletion strains in T. rubrum

研究最近生成了一个缺乏ku80的菌株，该基因参与非同源末端连接，用于在红色毛癣菌中进行有效的基因重组。基于该报告，我们在红色毛癣菌Δku80菌株中生成了单个Cyp51同工酶的缺失菌株。cyp51A缺失菌株表现出与亲本Δku80菌株相当的生长，这与之前对突变体的观察一致。有趣的是，cyp51B缺失菌株表现出显著的菌丝生长缺陷，这在独立生成的缺失菌株中也一致观察到。这一发现表明，在标准培养条件下，Cyp51B对红色毛癣菌的基础菌丝生长至关重要。

表达分析显示，当cyp51A被删除时，cyp51B mRNA没有补偿性上调，表明基础cyp51B mRNA表达足以在营养培养基中维持正常生长。然而，在cyp51B缺失菌株中，cyp51A mRNA表达上调。此外，暴露于唑类药物可诱导cyp51A mRNA表达，但不诱导cyp51B mRNA表达，这表明Cyp51A作为一种诱导型同工酶，响应于不充分的麦角固醇合成。

Differential sensitivity of Cyp51 isozyme deletion mutants to azole antifungals

为了深入了解抗真菌药物的Cyp51同工酶选择性，研究测定了17种临床抗真菌药物和13种农药对Δku80、Δcyp51A和Δcyp51B菌株的最低抑菌浓度。Δcyp51A菌株对大多数唑类抗真菌药物的MIC降低了2至256倍。氟康唑显示出64倍的降低，是抗真菌药物中最高的，而苯醚甲环唑显示出256倍的降低，是所有测试化合物中最高的，而泊沙康唑、拉诺康唑和卢立康唑的MIC值没有改变。仅含有Cyp51B同工酶的Δcyp51A菌株药物敏感性增加，表明大多数唑类抗真菌药物对Cyp51B的选择性高于对Cyp51A的选择性。Δcyp51B菌株仅对艾沙康唑和丙氯唑的MIC降低了四倍以上，但对异康唑、咪康唑、奈替康唑、奥昔康唑和硫康唑的MIC增加。这些数据表明，Cyp51A主要介导红色毛癣菌对大多数唑类抗真菌药物的天然耐受性，并且不同的唑类药物可能对Cyp51同工酶表现出不同的选择性。

Synergistic effects of azole combinations

基于Δcyp51A和Δcyp51B菌株不同的唑类敏感性，研究探索了唑类药物组合的潜在协同效应。研究选择了对Δcyp51B菌株MIC值变化倍数最高的丙氯唑，以及对Δcyp51A菌株MIC值变化倍数相对较高的氟康唑、硫康唑和抑霉唑进行组合研究。在野生型菌株中，与氟康唑、硫康唑和抑霉唑组合的分数抑制浓度指数分别为0.32、0.33和0.29，表明存在协同效应。Δku80菌株表现出相似的FIC指数，而Δcyp51A和Δcyp51B菌株的FIC指数则不同。这些数据表明，双重唑类药物组合可能是一个值得进一步研究的有前景的策略。

为了研究唑类抗真菌药物组合是否对基因组中拥有Cyp51A和Cyp51B的其他真菌物种产生协同效应，研究测试了这些组合对同样拥有两个Cyp51同工酶的曲霉的作用。丙氯唑与氟康唑、硫康唑和抑霉唑的组合针对相对唑类敏感的IFM 57545菌株和相对唑类耐药的IFM 63877菌株进行了测试。FIC指数表明这些组合存在协同效应。这些数据支持该策略对抗其他病原真菌的潜力。

DISCUSSION

本研究证明，在红色毛癣菌中删除Cyp51同工酶显著改变了生物体对唑类抗真菌药物的敏感性。在Cyp51同工酶缺失菌株中观察到的差异MIC值可能反映了唑类抗真菌药物对这些同工酶的不同亲和力。这一解释与先前在烟曲霉中的生化研究一致，该研究中重组蛋白分析显示，与Cyp51B相比，Cyp51A与唑类抗真菌药物的解离常数高出3.0至37倍。尽管这些发现与关于Cyp51A在唑类耐受性中主要作用的观察相似，但仍需要使用红色毛癣菌重组Cyp51同工酶的直接生化研究来确认该物种中的类似结合特性。

使用同工酶缺陷突变体，研究证明了Cyp51A和Cyp51B在红色毛癣菌中执行不同的功能。Cyp51B对基础生长至关重要，Δcyp51B菌株中观察到的严重生长抑制证明了这一点。相反，Cyp51A对基础生长不是必需的，但在唑类抗真菌治疗下被诱导并促进耐受性。这种功能分化与相关真菌中的观察结果显著不同。例如，在烟曲霉中，删除Cyp51A或Cyp51B均未显著影响菌丝生长。类似地，红色毛癣菌的近亲须癣毛癣菌在删除Cyp51B后仅表现出最小的生长损伤。这些对比发现表明，增殖对Cyp51同工酶的依赖性因物种而异。这些对比发现表明，红色毛癣菌进化出对Cyp51B更大的依赖性以进行必需的麦角固醇生物合成，这可能反映了其对人类皮肤和指甲角化环境的特殊适应。这种特殊的生态位可能需要更严格地控制固醇组成，使得Cyp51B的功能相对于腐生或较少宿主适应的真菌而言对生存更为关键。

观察到的具有不同同工酶选择性的唑类药物组合的协同效应具有重要的治疗意义。这一发现不仅为皮肤癣菌病提出了新的治疗策略，也可能适用于由其他拥有多个Cyp51同工酶的真菌引起的感染，包括曲霉属、镰刀菌属以及潜在的毛霉目真菌，这些感染中药物耐药性仍然是一个问题。同工酶删除后对唑类药物的差异反应并非红色毛癣菌独有；镰刀菌属物种中也报道了唑类敏感性在同工酶之间的类似变异。尽管先前的一项研究报道了在一些毛霉目分离株中抗真菌唑类药物之间存在协同效应，但其潜在机制仍不清楚。我们的研究表明，同工酶选择性是驱动这些协同相互作用的关键因素。研究观察到相当数量的化合物对Cyp51B同工酶表现出强选择性。相反，仅有有限数量的化合物对Cyp51A同工酶表现出高特异性。在未来的研究中，有必要鉴定对Cyp51A具有高特异性的化合物，这可能反过来导致发现具有更强协同效应的化合物组合。

这项研究为抗真菌药物的开发开辟了新途径。开发专注于同工酶特异性的筛选系统可以识别出具有改善抗真菌活性的唑类药物组合。重要的是，我们的结果可能会重新激发对那些先前在药物开发过程中因其整体抗真菌活性明显较弱而被忽视的化合物的兴趣。这些化合物可能被忽视并非因为它们本身无活性，而是因为它们的活性是同工酶选择性的，因此在标准测定中被掩盖。这些化合物可能具有有价值的同工酶特异性抑制特性，可在联合治疗方法中加以利用。虽然我们的体外研究结果显示了明确的协同潜力，但我们在蚕感染模型中使用氟康唑和丙氯唑进行的初步体内研究未能证明体外观察到的协同效应。这种差异可能是由于丙氯唑作为一种农用农药具有较差的药代动力学特性。未来的研究应侧重于识别具有类似Cyp51A选择性的临床适用化合物，并进行全面的体内功效评估以验证这种联合治疗方法。我们的发现揭示，Cyp51同工酶选择性代表了一个先前未充分探索的抗真菌协同作用机制，为针对皮肤癣菌病和其他真菌感染的精准联合疗法提供了理性基础。

MATERIALS AND METHODS

Chemicals

所列化学品均从指定公司购买，并用二甲基亚砜溶解，确保MIC测定中DMSO终浓度低于1%。

Fungal and bacterial strains and culture conditions

红色毛癣菌CBS118892和Aspergillus welwitschiae IFM 57545及IFM 63877菌株在特定培养基和条件下培养，分生孢子悬液按所述方法制备。

Plasmid construction

使用所述引物和试剂盒构建了cyp51A和cyp51B靶向载体。

Transformation of T. rubrum

使用PEG方法转化红色毛癣菌，并通过PCR评估所需转化子。

Antifungal susceptibility assay

根据CLSI的微量肉汤稀释法测定MIC，并计算FIC指数以评估协同作用，定义为FIC指数≤0.5。

Quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR)

使用所述试剂和方法提取RNA、合成cDNA并进行qRT-PCR，以Chitin synthase I (chs1)作为内参基因标准化样品。

Statistics

使用GraphPad Prism 9进行单因素方差分析和Tukey事后检验，以比较菌丝生长直径和Cyp51 mRNA表达水平的平均值，P < 0.05认为差异显著。

ACKNOWLEDGMENTS

作者感谢所列人员的技术帮助，并声明研究得到了武藏野大学、武田科学基金会和JSPS KAKENHI资助的部分支持。