免疫缺陷患者长期新冠病毒排毒（≥8周）的临床结局与病毒动力学：一项2020-2024年多中心回顾性队列研究

　　本刊推荐：本研究聚焦于免疫缺陷患者（ICPs）中SARS-CoV-2长期排毒（>8周）的临床与病毒学特征。研究显示，此类患者重症率高（32%），侵袭性霉菌感染（IMIs）发生率达17%，且实体器官移植（SOT）患者临床恢复更快。直接抗病毒药物（如瑞德西韦和尼马瑞韦/利托那韦）较单克隆抗体（mAbs）或恢复期血浆能更显著加速病毒清除（P=0.03），且未检测到相关耐药突变。研究强调了对ICPs需采用强化抗病毒策略的必要性。

　　

ABSTRACT

免疫缺陷患者（ICPs）感染SARS-CoV-2后面临更高的重症风险。部分患者经历超过八周的持续性病毒排毒，这与死亡率增加和侵袭性真菌感染相关。然而，关于这些患者的临床特征、治疗影响及标准化管理的数据仍然有限。研究在2020年3月1日至2024年2月10日期间于巴黎中心医院集团进行了一项回顾性队列研究，评估了有症状且存在持续性SARS-CoV-2排毒（>8周）的ICPs，分析了其临床进展、病毒清除时间以及与治疗方案相关的耐药突变出现情况。研究共纳入53名患者：53%为实体器官移植（SOT）受者，42%患有血液系统恶性肿瘤（HMs），5%存在其他免疫抑制条件。32%的患者发生重症感染，91%需要住院治疗，17%（n=9）出现侵袭性霉菌感染。SOT受者比HM患者更快达到临床治愈（P<0.01）。与接受单克隆抗体（mAbs）或恢复期血浆治疗的患者相比，接受直接抗病毒药物治疗的患者病毒清除速度显著更快（P=0.03）。未出现针对瑞德西韦或尼马瑞韦/利托那韦的耐药突变。然而，54%的病毒株对mAbs表现出刺突蛋白的初始或获得性耐药。直接抗病毒疗法，特别是瑞德西韦和尼马瑞韦/利托那韦，在促进有症状的持续性SARS-CoV-2感染ICPs的更快病毒清除和临床康复方面显得安全有效。

INTRODUCTION

COVID-19大流行目前已得到很大程度的控制，这得益于COVID-19疫苗的广泛使用，其发病率在2024-2025年冬季期间全球范围内急剧下降。大流行三年半多后，病毒持续发生遗传进化，当前变异株表现出高传播性（RX）和对所有单克隆抗体疗法（mAb）的耐药性。Omicron JN.1变异株及其后代目前在全球占主导地位，并持续分化为亚系，如KP.3.1.1或NB.1.8.1。免疫缺陷患者（ICPs）在发达国家约占一般人口的3%至6%，他们仍然面临严重和持续性SARS-CoV-2感染的高风险，这与高死亡率相关。 prolonged SARS-CoV-2病毒排毒——持续超过八周——与持续症状、刺突蛋白突变、住院、侵袭性曲霉病以及死亡风险增加有关。因此，临床医生在管理受SARS-CoV-2影响的这类免疫缺陷人群（包括存在持续性排毒的患者）时继续面临困难，因为针对该人群的前瞻性研究有限，缺乏标准化的、基于共识的治疗指南。持续性病毒排毒可在暴露于未能清除病毒的抗病毒药物后观察到，并可能诱导耐药突变和新变异株的出现。本文介绍了一项回顾性队列研究，描述了根据所接受治疗的不同，ICPs中持续性SARS-CoV-2病毒排毒（>8周）期间的临床结局、病毒清除情况以及病毒学特征，包括耐药相关突变的发生率。

MATERIALS AND METHODS

Study design and definitions

这项回顾性队列研究在巴黎中心医院集团进行，纳入了2020年3月1日至2024年2月10日期间SARS-CoV-2病毒排毒持续超过56天（>8周）的免疫缺陷成年患者。

Patients definition and inclusion criteria

持续性病毒排毒的定义是在超过8周的时间内至少两次SARS-CoV-2 PCR检测（鼻咽拭子）呈阳性，且在此期间没有阴性检测结果或确认的再感染（除非在第一次鼻咽qPCR阴性后的两天内有重复qPCR检测阳性的证据，这被视为假阴性）。鉴于缺乏免疫缺陷患者持续性病毒排毒的共识定义，并参照Machkovech等人最近提出的定义（>30天），我们选择研究一个更为特异的人群，即病毒排毒持续非常长时间（>8周）的患者，这类患者通常也出现众多并发症和治疗困难。这项工作是之前已发表研究的延续。

纳入的ICPs患有原发性免疫缺陷、HIV且CD4计数<200 cells/μL、活动性血液系统恶性肿瘤、实体器官移植（SOT）后或接受免疫抑制治疗（如抗CD20疗法、钙调神经磷酸酶抑制剂、霉酚酸酯、mTOR抑制剂、贝拉西普、Janus激酶抑制剂、venetoclax、布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂或长期皮质类固醇治疗（相当于泼尼松≥5 mg/天，持续超过3个月）等条件。严重SARS-CoV-2感染定义为需要住院并使用>3L氧气和/或皮质类固醇或托珠单抗。

Data collection and outcome measures

收集的数据包括临床和影像学表现、SARS-CoV-2变异株、qPCR Ct值、基础疾病、免疫抑制治疗和特定的抗COVID-19疗法。还收集了临床和影像学结局、治疗后（或未治疗患者感染期间）的病毒载量动力学和测序结果，以及并发症的发生情况：死亡、住院、以及根据EORTC/MSG定义的可能或确诊的侵袭性霉菌感染（IMIs）。结局包括临床治愈（症状消失）、病毒清除（即qPCR阴性）、CT扫描影像学 resolution，以及并发症，如IMIs、住院和死亡。对于多次治疗，如果两种治疗的开始时间相差不超过五天，则视为同一线治疗。

Sample preparation and sequencing

对至少有两个可用样本（间隔至少一周以确保时间数据稳健）的患者进行了测序分析。对于接受治疗的患者，我们选择了在接受抗SARS-CoV-2治疗前后收集的可用样本。为了获得最佳测序效果，在治疗前后收集的样本中，我们选择了周期阈值（Ct）<28的样本中Ct值最低者。由于测序结果不佳或共识序列质量差而无法使用的样本，由另一个符合最佳质量标准的可用样本替代。此选择过程确保了研究队列中可靠的时间一致性、治疗相关性和数据质量。在选定的样本中，使用NucleoSpin 8病毒核心试剂盒（Macherey-Nagel）提取核酸，然后使用LunaScript Supermix（NEB）和Q5高保真DNA聚合酶（NEB）进行双重RT-PCR，并使用一池引物（来自https://github.com/artic-network/primer-schemes/tree/master/nCoV-2019/V5.3.2的ARTIC V5.3.2）。纯化的扩增子在微生物学共享平台上使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina）在NextSeq 500/2000系统（Illumina Inc.）上进行测序。

Mutation and resistance analysis

对每个样本，使用内部生物信息学流程生成共识序列。该流程包括使用minimap2 (v2.26)和BWA (v0.7.17)进行读段比对，以及使用iVar (v1.3.1)进行变异 calling 和共识序列构建。共识序列反映了优势病毒种群，通过合并读段频率超过60%的核苷酸位点构建。低于40%的次要变异（可能影响病毒进化和耐药性）也被记录。对于次要变异，应用5%的频率阈值以排除低频噪声。读段频率在40%至60%之间的突变用模糊核苷酸标记，以考虑宿主内多样性。使用Nextclade (v3.8.2)进行谱系分配和系统发育注释，遵循全球SARS-CoV-2进化枝系统并评估序列质量。使用MAFFT (v7.525)进行多序列比对生成系统发育树（样本按患者和Pango谱系颜色编码），并使用IQ-TREE (v2.2.2.2)以最大似然法和通用时间可逆模型推断系统发育关系。使用斯坦福冠状病毒抗病毒与耐药数据库（2024年5月14日更新；https://covdb.stanford.edu/susceptibility-data/table-mab-susc/）在共识序列和次要变异中筛选耐药突变。仅报告在至少一个队列样本中鉴定出的突变及其相应药物。

Statistical analysis

为比较两组间连续变量和二分变量的分布，分别使用χ2检验或双尾Fisher精确检验。所有检验均为双尾，P<0.05被认为具有统计学意义。使用χ2或Fisher精确检验评估分类数据的治疗效果（例如，sotrovimab、nirmatrelvir/ritonavir、remdesivir、casirivimab/imdevimab、tixagévimab/cilgavimab和血浆疗法），并使用对数秩检验进行生存分析，显著性设定为P<0.05。使用STATA v17.0进行分析。

RESULTS

在研究纳入期间，共纳入53名存在持续性病毒排毒（>8周）的ICPs。Omicron是该队列中最具代表性的变异株（86%）。

Characteristics of patients at diagnosis

患者诊断时的特征如表1所示。中位年龄为60岁（四分位距[IQR]: [51–71]），64%为男性。28名患者（28/53; 53%）为SOT受者（2例心脏，23例肾脏，2例肺，1例肝肾联合移植），而42%患有血液系统恶性肿瘤（HMs）（22/53；其中包括2名SOT受者，其HM被视为主要基础疾病）。最具代表性的HMs是非霍奇金淋巴瘤（12/22）、慢性淋巴细胞白血病（3/22）和急性髓系白血病（2/22，其中1例为造血干细胞移植，HSCT）。其他HMs包括多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合征（伴难治性血细胞减少）、幼淋巴细胞白血病和毛细胞白血病各1例。9%（5/53）患有其他类型的免疫抑制。在SOT受者中，从移植到SARS-CoV-2诊断的中位时间为25（3–96）个月。

在纳入的53名患者中，8人的预防用药数据不可用。在可用数据中，16人未接受任何预防措施（无论是疫苗还是单克隆抗体）。在29名接受预防的患者中，3人接种了一剂疫苗，7人接种了两剂，15人接种了三剂，4人接种了四剂疫苗。在接种两剂的患者中，有两人还接受了tixagevimab/cilgavimab作为预防，而在接种三剂的患者中，有10人接受了单克隆抗体预防（7人使用tixagevimab/cilgavimab，3人使用casirivimab/imdevimab），接种四剂的患者中有一人也接受了tixagevimab/cilgavimab预防。一名患者仅接受了tixagevimab/cilgavimab预防。最具代表性的免疫抑制治疗是皮质类固醇（62%）、霉酚酸酯（45%）、钙调神经磷酸酶抑制剂（43%）和CD19/20抑制剂（32%）。61%的患者抗SARS-CoV-2 IgG水平<260 BAU/mL。患者常有合并症，包括40%患有高血压，23%患有糖尿病。

Clinical evolution and complications

48名患者在SARS-CoV-2感染期间住院（表2）：13人因无需氧疗的上或下呼吸道感染入住日间医院，35人入住普通病房。其中29人患有肺炎；6人出现一般状况改变，包括3人体重减轻、2人 prolonged fever、2人急性肾损伤；6人因临床症状和基础疾病住院。在可获得信息的28名患者中，从诊断到住院的中位时间为46天（15–94）。17名住院患者患有严重感染（定义为需要住院并使用>3L氧气和/或皮质类固醇或托珠单抗），其中包括10名HM患者（10/17; 59%）。此外，大多数（28/34; 82%）有胸部CT扫描可用的患者在诊断时存在符合SARS-CoV-2感染的病变，主要为轻度（影响10%至25%的肺部）。

在随访期间，47名有可用数据的患者中有41人（87%）达到临床治愈。重症患者达到临床治愈的中位时间显著长于非重症感染者（213 [148–258] 天 vs. 71 [28–130] 天；P=0.04）。即使在调整疾病严重程度后，SOT受者达到临床治愈的速度也快于HM患者（28 [7–71] 天 vs. 162 [80–227] 天；P<0.01）（图1）。接受CD20/19抑制剂治疗的患者症状持续时间显著长于未接受者（162天 [103.5–281] vs. 37天 [7.5–66]；P<0.01），即使在调整疾病严重程度后也是如此。抗SARS-CoV-2 IgG水平<260 BAU/mL或存在CD20/19抑制剂与达到临床治愈的可能性无关（分别为P=0.68和P=0.07）。17%的患者（n=9）经历了IMIs，包括8例曲霉病和1例烟曲霉与根霉属共感染（表2）。IMIs更可能发生在重症SARS-CoV-2患者中（41% vs. 6%，P=0.03）。IMIs倾向于与增加的6个月和1年死亡率相关（P=0.06）。在这些存在持续性病毒排毒的患者中，1年死亡率与重症SARS-CoV-2显著相关（P=0.04），其定义为需要使用地塞米松和/或托珠单抗。

Characteristics of the treatment received and impact on clinico-radiological outcomes

75%（40/53）的患者接受了至少一种抗SARS-CoV-2治疗。从诊断到开始治疗的中位时间为3天（1–42）。在24名接受超过一种治疗的患者中，41%（10/24）在21天内接受了所有线治疗，而另外59%则是在更长的时间内序贯治疗（图S1）。

一线治疗详见表3。患者可能接受了单独的直接抗病毒药、单独的mab、单独的血浆、抗病毒药+mab联合或抗病毒药+血浆联合。当尼马瑞韦/利托那韦作为一线治疗时，治疗持续时间始终为5天，而瑞德西韦的中位治疗时间为3天。由于每种治疗策略的样本量较小，未对这些组间的结局进行统计学比较。然而，表S1提供了根据一线治疗策略描述的临床治愈时间、病毒清除时间和CT恢复正常时间的数据。总体而言，接受直接抗病毒药物治疗的患者似乎有更好的结局。因此，进行了分析以比较涉及直接抗病毒药物的治疗策略与未涉及该策略的结局。即使在调整混杂变量（即疾病严重程度和基础疾病）后，一线使用直接抗病毒药物治疗对临床治愈时间或影像学恢复正常时间均无显著影响。在住院患者中，有12人先前在门诊接受过直接作用抗病毒药物单药治疗（n=6）、单克隆抗体（mAbs）（n=5）或两者联合（n=1）治疗。与其它一线治疗策略相比，在接受涉及血浆疗法（n=12）作为一线治疗后，调整疾病严重程度、主要基础疾病和治疗开始时间后，其对临床治愈时间（中位数：无血浆68 [28–194] 天 vs. 有血浆111 [72–188] 天）或CT扫描恢复正常时间（中位数：无血浆126 [83–198] 天 vs. 有血浆321 [127–452] 天）均无显著影响（分别为P=0.11；和P=0.86）。8名接受血浆疗法治疗的患者出现了IMIs。血浆作为一线治疗或之后使用的患者的数据和结局详见表S3。

Virus dynamics during persistent infection

所有患者均表现出>8周的持续性病毒排毒，其中34人（65%）在随访期间最终实现病毒清除。实现病毒清除的患者中，病毒清除前的中位时间为125天（94–266）（表3）。值得注意的是，病毒清除时间不受疾病严重程度、基线抗SARS-CoV-2 IgG水平<260 BAU/mL（P=0.07）或基础疾病（SOT受者111 [93–271] 天 vs. HM患者142 [70–266] 天，P=0.67）的显著影响（表S2）。然而，在调整混杂因素后，涉及直接抗病毒药物的一线治疗显著加速了病毒清除，中位时间为107天（[51–118]，平均111天），而未接受瑞德西韦或尼马瑞韦/利托那韦治疗的患者为183天（[97–277]，平均224天）（P=0.04）（图2）。在12名接受涉及血浆疗法作为一线治疗的患者中，病毒清除的中位时间为266 [114–427] 天（vs. 无血浆115 [70–259] 天；在调整疾病严重程度、主要基础疾病和治疗开始时间后，P=0.14）。

根据方法部分和图S2（“样本制备与测序”和“突变与耐药分析”）所述，共选择了21名患者的50个样本进行进一步分析。抗SARS-CoV-2治疗前后样本的系统发育分析显示，大多数患者的病毒株密切相关，后期样本显示更长的分支，表明随时间推移突变积累（图3）。主要变异种群中出现的突变报告于图4。治疗前，在17名有治疗前测序数据的患者中，有13人（76%）已经表现出对抗SARS-CoV-2治疗的耐药突变。其中，只有两人（15%）曾接受mAbs作为预防，八人（62%）曾接种疫苗。在持续性病毒排毒期间，11/21名患者出现了突变，其中包括三人（患者5、12和15）没有任何先前的治疗压力（甚至没有mAb预防或疫苗暴露）。然而，这些患者中的大多数（8/11; 73%）是在接受治愈性治疗后（相对于mAb预防或疫苗接种）出现了耐药突变。具体而言，四名患者出现了直接导致对先前所接受治疗耐药的突变，且全部是基于mAb的治疗。突变包括Y453F（对casirivimab耐药，患者9在暴露于casirivimab/imdevimab后出现）、R346T（对cilgavimab和c135耐药，患者37在暴露于tixagevimab/cilgavimab后出现）、N450D和F486V（对tixagevimab、casirivimab、bamlanivimab和etesevimab耐药，患者48在暴露于tixagevimab/cilgavimab和血浆疗法后出现）以及K444R（对cilgavimab耐药，患者50在暴露于tixagevimab/cilgavimab后出现）。在接受治愈性mAbs治疗的六名患者中，仅两人未出现耐药突变。在接受血浆疗法的患者中，27%（3/11）出现了对mAbs耐药的刺突蛋白突变，其中包括两名先前暴露于mAbs的患者（患者48曾接受治愈性tixagevimab/cilgavimab，患者36在感染前接受过预防性mAbs）。有趣的是，第三名患者（患者3）在仅接受血浆疗法后出现了N450D和L455S突变，尽管其从未接受过mAbs或疫苗接种。在接受瑞德西韦治疗的五名患者中，四人未出现耐药突变。一名患者（患者36）在接受瑞德西韦加血浆疗法以及先前的预防性mAbs后，出现了对mAbs耐药的刺突蛋白突变（P499H）。在一名接种疫苗并接受尼马瑞韦/利托那韦单药治疗的患者中，尽管没有先前mAbs暴露史，但在治疗后出现了对cilgavimab的耐药（患者6）。

总体而言，19名患者在感染期间接受了单克隆抗体（mAbs）治疗，其中17人作为一线治疗。其中，8名患者有治疗前测序数据（临床医生在开始治疗时未知）。值得注意的是，其中四人（50%）尽管存在已知会降低SARS-CoV-2对这些抗体敏感性的预先存在的突变，仍然接受了治愈性mAbs（患者37、42、48和52）。次要变异分析显示，五名患者存在治疗耐药突变，其中包括两人对mAbs产生耐药（图S3）。然而，该分析的样本量较小，限制了关于这些突变对临床结局或病毒清除影响的任何结论。

DISCUSSION

存在持续性SARS-CoV-2病毒排毒（>8周）的ICPs代表了一个高度脆弱的人群，承受着显著的合并症（主要是高血压和糖尿病），诊断时抗SARS-CoV-2抗体水平低（近三分之二IgG水平<260 BAU/mL），并且重症感染发生率高（32%），这与先前的研究一致。近五分之一的患者（17%）发生了侵袭性霉菌感染，且不一定曾住进重症监护室，这与先前20%的报告相当。

涉及直接抗病毒疗法（即瑞德西韦和/或尼马瑞韦/利托那韦）的一线治疗与ICPs中更快的病毒清除相关，优于涉及mAbs或血浆疗法的治疗。此外，即使在先前没有对所用mAbs（主要是在“前Omicron”时期）耐药突变的患者中，血浆疗法或mAbs也未能显示出在减少病毒清除时间方面的优势。最近的研究一致表明，瑞德西韦与住院ICPs（特别是患有HMs或SOT者）的死亡率降低相关。此外，研究表明延长或联合使用直接抗病毒药物疗程可能对ICPs有益。因此，对深度免疫抑制患者（特别是SOT和HM）加强治疗策略似乎至关重要，这超出了指南提出的对重症或有合并症患者进行短期、早期抗病毒治疗的建议。实际上，对高危患者采用延长、系统的直接抗病毒药治疗方案，并在持续存在的情况下重复治疗，似乎是合理的。

最近的报告还指出，一些存在持续性SARS-CoV-2感染的ICPs可能因出现耐药突变而对直接抗病毒疗法（如瑞德西韦和尼马瑞韦/利托那韦）的反应减弱。在我们的系列研究中，我们未在主要SARS-CoV-2变异株中识别出任何这些特定的耐药突变，尽管85%的分析样本患者显示出对mAb(s)的预先存在或获得性耐药突变。研究表明，耐药突变的出现不一定由治疗诱导的选择压力驱动。事实上，SARS-CoV-2的进化很大程度上是由免疫逃逸塑造的，一些耐药相关突变已成为谱系定义特征。然而，对mAb(s)的耐药尤其出现在先前暴露于mAbs的患者中，但也出现在一名接受血浆疗法治疗的患者（1/11; 9%）中，该患者出现了对mAbs耐药的刺突蛋白突变。这类突变仅在五名接受瑞德西韦治疗的患者中的一人的主要变异中被观察到，但该患者也曾暴露于预防性mAbs和治愈性血浆疗法。

这项回顾性研究有几个局限性。首先，它聚焦于一个高度特异的人群（病毒排毒持续>8周的患者），并包含了异质性的基础疾病（如HM和SOT）和治疗方案。这些因素可能限制研究结果的普适性，且病例数少限制了统计效力。然而，我们已经确定瑞德西韦和尼马瑞韦/利托那韦是对这些存在持续性病毒排毒的住院免疫缺陷患者最有效的治疗方法，无论是在病毒清除效力还是遗传屏障方面。这在当前背景下尤其相关，因为Omicron变异株已对所有可用的治疗性单克隆抗体产生耐药。此外，即使开发出理论上对Omicron有效的新单克隆抗体，也需要证明其优于直接抗病毒药物。密切监测免疫缺陷患者在此类治疗或血浆疗法之前和期间的突变也至关重要。此外，在考虑任何未来病毒流行病或大流行的治疗建议时，应考虑到这些发现：单克隆抗体单药治疗与联合或重复的直接抗病毒疗法相比似乎是一种风险更高的选择。

Conclusion

本研究结果强调，使用直接抗病毒疗法（瑞德西韦和尼马瑞韦/利托那韦）是免疫缺陷患者（ICPs）中最有效的治疗手段，可减少SARS-CoV-2病毒清除时间（这与侵袭性霉菌感染相关），并且其遗传屏障是足够的。

ACKNOWLEDGMENTS

C.D.L.P.D.V.和C.M.构思了本研究。C.D.L.P.D.V.收集数据，进行统计分析，并撰写了手稿。K.D.S.撰写了手稿的病毒学部分并审阅了手稿。N.V.和M.-A.R.-V.为研究的构思做出了贡献，并审阅了论文。所有作者都仔细审阅了手稿。