新型锌螯合环状烷基多胺化合物APC6在多重耐药耳念珠菌感染小鼠模型中展现高效性与安全性

　　本研究首次证实锌螯合剂APC6（一种环状烷基多胺化合物）可通过特异性破坏真菌锌稳态，在多重耐药耳念珠菌（Candida auris）播散性感染小鼠模型中显著提高生存率（100%）、降低肝脏（降低1.226 log10 CFU/g）、肾脏及大脑真菌载量，且28天重复给药未见毒性反应。其疗效与两性霉素B相当或更优，Ames试验显示无致突变性，为应对多重耐药真菌感染提供了靶向营养免疫（Nutritional Immunity）的创新治疗策略。

　　

引言：全球侵袭性真菌感染负担的严峻挑战

侵袭性真菌感染在全球范围内持续增加，对公共卫生构成紧迫威胁，尤其在免疫功能低下人群（如接受化疗、器官移植或广谱抗生素治疗的患者）中更为显著。耳念珠菌（Candida auris）自2009年首次被发现以来，已成为一种重要的多重耐药酵母菌，在超过50个国家引起院内感染暴发，其血流感染死亡率超过30%。该菌株具有人际传播、环境持久存活和诊断困难等特点，且对现有抗真菌药物敏感性差：超过90%的临床分离株对氟康唑耐药，对伏立康唑、两性霉素B和棘白菌素的耐药性也在上升，部分菌株甚至对三大类主要药物（多烯类、唑类和棘白菌素类）全部耐药，被世界卫生组织列为“关键优先级”真菌病原体。

真菌与人类细胞的生物学相似性使得病原体特异性药物靶点的识别困难，且宿主毒性风险较高。当前获批的抗真菌药物主要靶向麦角固醇或β-葡聚糖生物合成通路，而具有新作用机制的候选药物（如靶向金属稳态、蛋白质酰化或线粒体功能）正在被积极探索。其中，靶向真菌金属稳态（尤其是锌和铁获取系统）的治疗策略近年来备受关注，这与营养免疫的概念相契合——即宿主通过限制必需金属离子（如锌）的可用性来抑制病原体生长。人血清中游离Zn²⁺浓度（约0.08 μM）远低于白色念珠菌或烟曲霉最佳生长所需的最低锌浓度，因此病原真菌必须高效获取锌以在宿主体内存活。哺乳动物免疫细胞通过钙卫蛋白等锌结合蛋白限制真菌对锌的利用，从而抑制其增殖。受此启发，模拟宿主锌 sequestration机制可能提供一种新型抗真菌治疗策略。

临床前研究已证实合成金属螯合剂作为抗真菌药物的潜力。化合物ZAC307和ZAC989可抑制白色念珠菌和烟曲霉的锌利用，在体外和小鼠模型中显著减少真菌生长；硫缩氨基脲衍生物NSC319726和19ak通过铁/锌螯合破坏线粒体呼吸和核糖体生物合成，并具有广谱抗真菌活性，其中NSC319726在耳念珠菌感染的蜡螟幼虫模型中有效。本研究关注的APC6（一种环状烷基多胺化合物）由乙二胺单元构成，能够螯合二价金属离子，其环状刚性结构可稳定形成金属络合物，吡啶甲基的引入进一步增强了金属结合亲和力。前期研究发现APC6与Zn²⁺形成1:1复合物（logK为17.25，超过EDTA），并通过浓度依赖性降低真菌细胞内锌水平发挥选择性抗真菌作用。转录组学分析表明APC6特异性诱导锌转运蛋白和 scavenger基因表达，而不影响其他金属离子相关基因，表明其通过锌剥夺发挥主要作用机制。APC6在体外对多种念珠菌（包括多重耐药耳念珠菌）具有抑制活性，且在蜡螟模型中显示治疗潜力，但其在哺乳动物宿主中的有效性尚未可知。

APC6在小鼠体内表现出良好的安全性特征

本研究首先通过单剂量递减研究和28天重复给药毒性试验评估了APC6（化学结构见图1A）的安全性。单剂量研究中，45 mg/kg给药导致1天内死亡，30 mg/kg引起短暂震颤，而15 mg/kg耐受良好且无临床异常表现，因此被确定为最大耐受剂量。在重复给药研究中，小鼠连续28天腹腔注射APC6（15 mg/kg/天），期间未观察到显著临床异常，所有小鼠维持1级活动水平（非常活跃：高度好奇、快速强烈运动、正常摄食），体重变化与溶剂对照组无显著差异（图1B）。第28天的肝脏和肾脏组织病理学分析显示，APC6处理组未见大体形态学改变、炎症或纤维化：肝脏中格利森鞘（包括门静脉、肝动脉和胆管）清晰可见，无炎症细胞浸润或纤维化迹象；中央静脉、肝小叶和肝细胞正常，无变性或炎症证据；肾皮质肾小球结构保存良好，无肾小球萎缩、系膜增生或间质炎症。两组器官在显微镜下均无显著差异（图1C）。

APC6在播散性耳念珠菌感染小鼠模型中显著提高生存率

研究进一步在免疫抑制（环磷酰胺处理）小鼠中评估了APC6对静脉感染耳念珠菌的治疗效果。所用菌株包括AR 0384（分支III）和AR 0389（分支I），两者均对氟康唑高度耐药，其中AR 0384对棘白菌素（特别是卡泊芬净）耐药，AR 0389对两性霉素B耐药（见表S1）。小鼠分别感染5×10⁷ CFU（AR 0384）或3×10⁷ CFU（AR 0389），并从感染前24小时开始每天腹腔注射APC6（5或15 mg/kg），持续给药。感染后7天生存监测显示：AR 0384感染组中，溶剂对照组生存率为50%，APC6 5 mg/kg组为75%，15 mg/kg组达100%（图2A）；AR 0389感染组中，溶剂组生存率25%，5 mg/kg组75%，15 mg/kg组100%（图2B）。为验证APC6体内抗真菌活性是否由锌螯合介导并评估其长期疗效，研究还进行了AR 0384感染的21天生存实验，发现锌补充显著削弱了APC6的保护作用（图S1），支持锌螯合为其关键作用机制。这些结果表明APC6在播散性耳念珠菌感染模型中显著提高生存率。

APC6降低肝脏、肾脏和大脑中的真菌载量

感染后第3天，研究人员量化了器官中的菌落形成单位（CFU）。在AR 0384感染组中，APC6（15 mg/kg）较溶剂对照组显著降低真菌载量：肝脏平均减少1.226 log₁₀ CFU/g，肾脏减少1.170 log₁₀ CFU/g，大脑减少0.584 log₁₀ CFU/g（图3A；表1）。单药治疗中米卡芬净降低真菌载量效果最显著，但APC6与米卡芬净联用未显示叠加效应。在AR 0389感染组中，APC6（15 mg/kg）也显著降低真菌载量：肝脏减少1.056 log₁₀ CFU/g，肾脏减少1.498 log₁₀ CFU/g，大脑减少0.902 log₁₀ CFU/g（图3B；表2）。通过组织病理学分析进一步验证APC6抗真菌效果：在AR 0384感染小鼠的组织中（每只小鼠四个肝脏切片、两个肾脏和大脑切片），量化了真菌微脓肿（定义为≥10个酵母细胞的聚集），发现APC6处理组所有三个器官的真菌微脓肿数量均显著低于溶剂对照组（图S2）。

APC6在Ames试验中无致突变活性

为评估APC6的致突变性，研究使用鼠伤寒沙门菌 tester strains TA98和TA100（有或无代谢活化S9 mix）进行Ames试验。APC6在无代谢活化时≥4.88 μg/plate具细胞毒性，有代谢活化时≥19.5 μg/plate具细胞毒性。在所有测试浓度下，APC6未引起回复突变菌落数较溶剂对照组增加两倍或剂量依赖性增加（表3），表明在该试验条件下APC6无致突变性。

讨论：靶向锌稳态的创新抗真菌策略的转化前景

本研究首次证实锌螯合剂APC6在哺乳动物模型中对多重耐药耳念珠菌播散性感染具有强劲的体内疗效，能显著提高生存率并降低多器官真菌载量，且治疗剂量（15 mg/kg）下安全性良好，28天重复给药无显著不良反应，Ames试验显示无致突变性，从而将锌螯合确立为一种可行的抗真菌策略。尽管美国疾病预防控制中心推荐棘白菌素作为耳念珠菌感染的一线治疗，但耐药性正逐渐出现（对氟康唑耐药率93%，伏立康唑54%，两性霉素B35%，棘白菌素7%），且41%分离株对两类药物耐药、4%对三类全耐药，凸显了新型治疗策略的紧迫性。APC6对两种具有不同耐药机制的临床分离株（AR 0384和AR 0389）均有效，表明其可能通过多方面破坏真菌生理（如酶功能、应激反应和生物膜形成）发挥抗真菌作用。

虽然APC6在降低真菌载量上未超越米卡芬净，但其效果与两性霉素B相当或更优。值得注意的是，APC6靶向的作用机制与现有抗真菌药物不同，因此可能对固有耐药菌株（如镰刀菌、毛孢子菌和毛霉目成员）也有效，未来研究将扩展其在不同临床相关物种中的评价。靶向真菌金属稳态的策略可行性得到先前研究支持：白色念珠菌中的PRA1和ZRT1（及其在其他念珠菌中的直系同源基因）编码锌载体（zincophores），在锌限制条件下促进锌摄取；而APC6和19ak等锌螯合剂可降低真菌细胞内锌水平并显著上调锌载体相关基因，表明APC6可能通过竞争性抑制内源性锌载体诱导锌饥饿。除锌外，铁和铜等其他必需微量金属也成为潜在抗真菌靶点，铁螯合剂（如去铁酮和地拉罗司）在真菌感染（包括念珠菌病、毛霉病和曲霉病）的小鼠和人类模型中已显示鼓舞人心的结果。

APC6在治疗剂量下安全性良好，但确定最大耐受剂量时发现其有效剂量与毒性剂量之间范围较窄（45 mg/kg致死），这与通常具有较宽安全范围的常规抗真菌药物（如棘白菌素或唑类）形成对比，因此需进一步优化其给药策略或测试衍生物。Ames试验中APC6无致突变性，表明在治疗相关浓度下遗传毒性风险较低，但未来临床前评价仍需更全面的遗传毒性测试（包括哺乳动物细胞试验）。尽管APC6显示出有希望的体内有效性，其药物开发仍面临若干挑战：主要限制在于治疗益处与毒性之间的狭窄范围，鉴于锌与多种生物分子相互作用，螯合锌可能导致宿主细胞脱靶效应；虽然体外研究中对人类细胞毒性低，但需进行结构修饰以改善其安全性特征；本研究使用腹腔给药，未来临床开发需评估其口服或静脉给药可行性，并进行全面的药代动力学和药效学评估；此外，APC6在感染前24小时开始给药，未来需建立延迟治疗模型（感染后给药）以充分确定其临床适用性。

结论：APC6在多重耐药耳念珠菌感染模型中的有效性支持其作为新型抗真菌药物的用途，该研究确立了锌螯合剂作为抗真菌药物新类别，并突显其克服现有抗真菌疗法耐药性的潜力，为开发具有改进效力和安全性特征的未来抗真菌剂提供了宝贵信息。