肉桂醛适应性驱动铜绿假单胞菌抗生素耐药性演化的能量代谢权衡机制

　　本研究揭示了肉桂醛（CNA）长期暴露通过选择ATP合酶（ATP synthase）突变，导致铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素耐药性增强而对氨基糖苷类/多黏菌素敏感性上升的双向表型。突变体呼吸链质子驱动力（PMF）增强既促进MexAB-OprM外排泵功能又引起内膜超极化，为联合用药策略提供新视角。

　　

INTRODUCTION

随着抗生素耐药性问题日益严峻，植物提取物的抗菌特性受到广泛关注。精油中的含氧萜类化合物（如醇、醛、酯等）具有显著抗菌活性，常用于自我药疗。在法国，约40%的囊性纤维化（CF）患者常规使用精油联合抗生素治疗铜绿假单胞菌感染。肉桂精油主要成分肉桂醛（CNA）对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）低于800 μg/mL，抗菌活性显著高于丁香油、香叶天竺葵等其他精油。

然而，CNA的临床应用需警惕耐药性演化。短期暴露CNA后，铜绿假单胞菌通过激活NalC通路瞬时高表达MexAB-OprM外排泵，导致对β-内酰胺和氟喹诺酮类抗生素耐药性上升。前期研究通过体外长期CNA暴露筛选出10株CNA耐药突变体（MIC=900–1,100 μg/mL），其中8株因nalC突变导致MexAB-OprM过表达，另有3株意外出现对氨基糖苷类和黏菌素超敏感现象。

RESULTS

Efflux defect is not responsible for the hypersusceptibility to aminoglycosides in A1 and A3 mutants

突变体A1和A3对妥布霉素和庆大霉素的MIC较野生型PA14降低4-8倍。RT-qPCR显示mexY表达水平与野生型相当。删除mexXY基因或使用质子载体CCCP抑制RND外排系统后，氨基糖苷类MIC进一步降低，证明MexXY(OprM)泵功能正常，超敏感性与外排缺陷无关。

Mutants hypersusceptible to aminoglycosides have altered ATP synthase function

基因组测序发现A1和A3突变体的atp操纵子存在突变：A3的atpD基因发生P₃₀₅S替换（影响ATP合酶β亚基功能）；A1在atpI启动子区-95位存在-C缺失（使-10与-35框间距从14bp缩短至13bp）。RT-qPCR显示A1突变体atp操纵子所有基因（atpIBEFHAGDC）表达均下调。PA14atpI::MrT7转座子突变体实验证实atpI失活会导致氨基糖苷类敏感性上升。

Altered ATP synthase correlates with reduced fitness and impaired ATP production

A1和A3代时延长1.6倍，ATP产量显著降低。值得注意的是，MexAB-OprM过表达菌株（如A2）虽未发生atp突变，但ATP产量也轻微下降，推测因外排泵消耗质子导致能量代谢重构。

Cell surface charge remains unchanged in ATP synthase mutants

Zeta电位检测显示所有菌株表面电荷无显著差异（约-35 mV），排除外膜电性改变导致氨基糖苷类渗透性增强的可能。

Alteration in ATP synthase function correlates with minor modifications in respiratory chain activity

呼吸链基因表达谱分析显示仅A1突变体的sdhA（琥珀酸脱氢酶）显著下调。NADH氧化实验证实A1呼吸活性受损，但厌氧生长实验表明各菌株对缺氧环境适应性无差异。

Alteration in ATP synthase function correlates with proton gradient modifications beneficial to MexAB-OprM

BCECF/AM荧光探针检测发现A1和A3胞内pH升高，提示周质区质子积累。ATP合酶抑制剂DCCD处理可模拟该效应（除A3因atpD突变已失活）。PMF增强为MexAB-OprM提供更多质子动力，使A1对哌拉西林、氨曲南等β-内酰胺类MIC高于经典nalC突变体A2，A3（无nalC突变）对上述药物MIC也上升2倍。

ATP synthase mutants display hyperpolarization of their inner membrane associated with better uptake of the charged antibiotics aminoglycosides and colistin

DiSC₃(5)荧光染料检测显示A1和A3内膜超极化。膜破坏剂squalamine处理后荧光释放量显著高于野生型，证实Δψ增强。超极化状态促进带正电的氨基糖苷类和黏菌素穿膜运输，DCCD处理可重现该表型。squalamine使氨基糖苷类MIC进一步降低2倍。

Clinical strains of P. aeruginosa carry mutations in ATP synthase cluster

对2,500株临床分离株的基因组分析发现3.8%存在atp操纵子有害突变，其中32%分离自CF患者，证明该突变在临床环境中可被选择且保持致病性。

DISCUSSION

本研究揭示了CNA压力下铜绿假单胞菌通过atp操纵子突变实现能量代谢重编程的适应性策略：一方面，ATP合酶功能缺陷导致内膜超极化，增强带正电抗生素（氨基糖苷类/多黏菌素）的摄取；另一方面，PMF增强驱动MexAB-OprM外排泵高效工作，提升对β-内酰胺类抗生素耐药性。这种耐药/敏感表型的权衡（trade-off）可能影响细菌在CF患者肺内的定植能力。

ATP合酶抑制剂（如抗结核药物贝达奎尼）的应用可能增强氨基糖苷类疗效，但需警惕其对β-内酰胺类药物的拮抗效应。未来需通过体内实验验证atp突变菌株在抗生素/精油联合压力下的进化动力学。

MATERIALS AND METHODS

实验采用经CNA长期诱导的PA14衍生突变株（A1、A2、A3）。通过Illumina平台完成全基因组测序（BioProject: PRJNA663565）。药敏试验遵循EUCAST标准。采用RT-qPCR、基因敲除（pKNG101自杀载体）、ATP荧光检测（Biofax A Kit）、呼吸活性（alamarBlue染料）、膜电位（DiSC₃(5)染料）、Zeta电位等多技术手段验证表型与机制。统计学分析采用R软件完成ANOVA与Dunnett检验。