口服β-内酰胺联合疗法对鸟分枝杆菌的体外有效性及其克拉霉素耐药无关性研究

　　本研究通过体外药敏试验系统评估了口服及静脉β-内酰胺类药物对鸟分枝杆菌复合体（MAC）的协同抗菌效果，发现多种组合方案（如特比培南联合阿莫西林）对鸟分枝杆菌（M. avium）具有显著协同作用，且效果与克拉霉素（CLR）耐药性无关，为临床难治性MAC肺病提供了新的治疗策略。

　　

ABSTRACT

全球由鸟分枝杆菌复合体（Mycobacterium avium complex, MAC）引起的肺病发病率和患病率正在上升。MAC主要包括鸟分枝杆菌（M. avium）和胞内分枝杆菌（M. intracellulare）。然而，治疗MAC肺病在克拉霉素（clarithromycin, CLR）耐药的情况下，或当患者出现不良反应或药物相互作用时，具有挑战性。因此，开发针对MAC的新型高效抗生素至关重要。虽然双重β-内酰胺疗法对脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）的疗效已受到关注，但其对MAC的疗效尚不清楚。

本研究使用MAC标准菌株和临床分离株，通过肉汤微量稀释棋盘法评估了6种口服和22种静脉注射抗生素的组合效果，以确定双重β-内酰胺是否对MAC有效，以及哪些组合能协同抑制细菌生长。研究结果显示，β-内酰胺的组合效果和抗菌活性在M. avium和M. intracellulare之间存在差异。针对M. avium标准菌株，有5种口服β-内酰胺组合和78种静脉β-内酰胺组合显示出协同效应。在M. avium临床分离株中，法罗培南（faropenem）与头孢呋辛（cefuroxime）的组合显示出最高的协同效应，而阿莫西林（amoxicillin）与特比培南（tebipenem）的组合则表现出最低的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）。在这些组合中，CLR敏感和CLR耐药的M. avium临床分离株之间的协同效应没有显著差异。

总之，无论CLR敏感性如何，口服β-内酰胺组合对M. avium均有效。因此，在治疗MAC肺病时，确定是由M. avium还是M. intracellulare引起至关重要。

IMPORTANCE

鸟分枝杆菌复合体引起慢性呼吸道感染，但治疗常受耐药性、不耐受或药物相互作用的限制。由于急需新的治疗策略，我们聚焦于广泛使用且耐受性良好的β-内酰胺抗生素。尽管双重β-内酰胺对脓肿分枝杆菌有效，但其对鸟分枝杆菌复合体的效用尚未深入探索。我们的体外研究表明，几种β-内酰胺组合对鸟分枝杆菌有效，且与耐药性无关，显示出临床应用的潜力。相比之下，胞内分枝杆菌对β-内酰胺的敏感性较低。鉴于这种药物敏感性的差异，我们强调在临床上需要区分鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，以优化MAC肺病的治疗。

INTRODUCTION

非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria, NTM）引起的肺病全球发病率和患病率正在增加，其中包括鸟分枝杆菌复合体（MAC）。MAC是一组缓慢生长的分枝杆菌，主要包括M. avium和M. intracellulare，是全球最常见的NTM。

MAC肺病的标准治疗是联合化疗，包括大环内酯类（克拉霉素或阿奇霉素）、乙胺丁醇和利福平，并根据疾病严重程度加用链霉素或阿米卡星。大环内酯类是治疗MAC肺病的主要抗生素。然而，大环内酯类单药治疗是导致大环内酯类耐药MAC的最常见原因。CLR耐药定义为CLR的MIC≥32 μg/mL。尽管标准治疗对CLR敏感MAC所致肺病的痰培养转化率为53.3%–77.4%，但对CLR耐药MAC所致肺病的转化率已降至14%–30%。目前尚无针对CLR耐药MAC肺病的既定有效治疗方案，且预后较差。乙胺丁醇、利福平和氨基糖苷类也通常用于MAC肺病治疗，但这些药物可引起视神经病变和听觉神经病变等不良反应，且利福平可诱导细胞色素P450酶，显著降低其他通过该酶代谢药物的血浆浓度。对于感染CLR耐药MAC或出现不良反应或药物相互作用的患者，治疗具有挑战性，因为可用抗生素有限。因此，开发针对MAC，特别是CLR耐药MAC的新型高效抗生素至关重要。

新药开发是一个漫长且昂贵的过程。药物重定位是一种将已批准或处于后期临床试验的药物重新用于治疗其初始目标以外的疾病的方法，能够更快地提供新的疾病疗法。β-内酰胺类药物在临床实践中常用，因此其人体安全性已得到确认。最近，双重β-内酰胺疗法对脓肿分枝杆菌的疗效已在体外和体内得到报道。该组合的作用机制涉及靶向称为青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins, PBPs）的酶。与脓肿分枝杆菌类似，MAC基因组编码几种PBPs。因此，我们假设双重β-内酰胺可能也对MAC表现出协同效应。目前有两篇关于双重β-内酰胺对MAC疗效的报道。Negatu等人评估了九种口服β-内酰胺对MAC的效果，揭示了头孢呋辛与特比培南或苏洛培南的组合对M. avium具有协同作用。Al-Jabri等人报道，美罗培南与头孢洛林、头孢地尼或头孢呋辛联合可显著降低美罗培南的MIC。然而，由于这些研究仅使用了少数β-内酰胺组合，目前尚不清楚哪些β-内酰胺组合对MAC最有效。此外，PBPs在细菌物种之间存在差异。由于关于MAC中PBPs结构与每种β-内酰胺相互作用的报道很少，因此难以预测β-内酰胺的联合效应。因此，有必要对临床实践中使用的β-内酰胺进行全面评估，以确定有利的组合。

因此，本研究旨在确定双重β-内酰胺是否对MAC有效。我们还尝试鉴定对MAC标准菌株具有协同效应的双重β-内酰胺，并验证其针对临床分离的MAC（包括CLR耐药菌株）的抗菌活性。

RESULTS

Oral β-lactam combinations showed synergistic effects against the M. avium type strain but not against the M. intracellulare type strain

在进行主要实验之前，我们测量了三种β-内酰胺（青霉素G、头孢唑林和特比培南）单独使用或与各种β-内酰胺酶抑制剂联合使用对M. avium ATCC700898和M. intracellulare ATCC13950的MIC。对于两种菌株，青霉素G、头孢唑林和特比培南与任何测试的β-内酰胺酶抑制剂（8 μg/mL）联合使用时，MIC均未降低。然而，舒巴坦和他唑巴坦对M. avium ATCC700898的MIC为64 μg/mL，高于三种测试β-内酰胺的MIC。因此，在后续实验中，我们没有在所有组合中添加β-内酰胺酶抑制剂。

我们首先使用六种口服β-内酰胺的组合，通过棋盘法评估对MAC标准菌株的双重β-内酰胺疗效。五种组合对M. avium ATCC700898显示出协同效应。这些抗生素单独使用和联合使用的MIC如表1所示。特比培南和阿莫西林的组合具有最低的 fractional inhibitory concentration (FIC) 指数（0.38）和最低的MIC（分别为2和0.5 μg/mL）。没有一种口服β-内酰胺对M. intracellulare ATCC13950显示出协同效应。口服β-内酰胺对M. intracellulare ATCC13950的MIC高于对M. avium ATCC700898的MIC。

Intravenous β-lactam combinations showed synergistic effects against MAC type strains

接下来，我们使用棋盘法评估了22种静脉注射β-内酰胺组合对MAC标准菌株的疗效。针对M. avium ATCC700898，观察到78种组合具有协同效应。氨曲南与多利培南或美罗培南的组合显示出最低的FIC指数，但即使联合使用，氨曲南的MIC仍然很高（32 μg/mL）。最低的MIC为1 μg/mL–2 μg/mL，与口服β-内酰胺的MIC相当。针对M. intracellulare ATCC13950，观察到51种静脉注射组合具有协同效应。在这些组合中，24种包括静脉注射碳青霉烯类（亚胺培南、美罗培南或多利培南）。亚胺培南和苯唑西林的组合显示出最低的FIC指数，但苯唑西林的MIC显著较高（64 μg/mL）。头孢曲松与多利培南或美罗培南的协同组合显示出最低的MIC（2 μg/mL–8 μg/mL）。静脉注射β-内酰胺对M. intracellulare ATCC13950的MIC高于对M. avium ATCC700898的MIC。

MICs of oral β-lactam therapy against M. avium clinical isolates

我们观察到针对M. avium标准菌株，有5种口服β-内酰胺组合和78种静脉注射β-内酰胺组合具有协同效应。为了确认口服β-内酰胺组合对门诊患者M. avium肺病的疗效，我们测量了五种口服β-内酰胺（阿莫西林、头孢氨苄、头孢呋辛、特比培南和法罗培南）对56株临床分离株（CLR敏感，n=29；CLR耐药，n=27）的MIC，并计算了MIC₅₀、MIC₉₀值和FIC指数。

针对CLR敏感和CLR耐药的M. avium菌株，五种口服β-内酰胺单独使用的MIC如表3和表S5所列。对CLR耐药M. avium菌株的MIC₅₀和MIC₉₀值几乎是对CLR敏感菌株的两倍。此外，对CLR耐药M. avium菌株的MIC范围比CLR敏感菌株更宽。表4和表S6显示了五种口服β-内酰胺组合（头孢呋辛与阿莫西林、头孢呋辛与头孢氨苄、头孢呋辛与法罗培南、特比培南与阿莫西林、特比培南与头孢氨苄）对M. avium临床菌株的MIC。针对CLR敏感分离株，特比培南的MIC₅₀和MIC₉₀值在与阿莫西林或头孢氨苄联合时从4/8 μg/mL降低至1/4 μg/mL，而阿莫西林或头孢氨苄的MIC₅₀和MIC₉₀值也分别从8/16 μg/mL降低至2/8和2/4 μg/mL。这种MIC的降低在CLR耐药分离株中也观察到，特比培南的MIC₅₀和MIC₉₀值从8/16 μg/mL降低至2/8 μg/mL，联合使用4/8 μg/mL的阿莫西林。尽管头孢氨苄的MIC₅₀和MIC₉₀值为8/16 μg/mL，但特比培南的MIC降低至1/8 μg/mL。头孢呋辛的MIC在组合中也降低，但效果不如特比培南。

Combinations of two oral β-lactams were effective against M. avium clinical isolates regardless of CLR susceptibility

针对29株CLR敏感和27株CLR耐药的M. avium临床分离株，使用五种口服β-内酰胺组合的MIC来计算FIC指数。这些指数在M. avium菌株临床分离株中的范围从0.19到1.0，表明口服β-内酰胺组合对所有临床分离株均显示出协同或相加效应。每种组合显示协同效应的菌株数量不同。头孢呋辛和法罗培南的组合在15/29（52%）的CLR敏感菌株和16/27（59%）的CLR耐药菌株中显示出协同效应，而特比培南和阿莫西林的组合在2/29（7%）的CLR敏感菌株和3/27（11%）的CLR耐药菌株中显示出协同效应。在所有组合中，CLR敏感和CLR耐药菌株之间的FIC指数没有显著差异（头孢呋辛与阿莫西林，P=0.75；头孢呋辛与头孢氨苄，P=0.29；头孢呋辛与法罗培南，P=0.32；特比培南与阿莫西林，P=0.90；特比培南与头孢氨苄，P=0.48）。

Intravenous β-lactam combinations showed a synergistic effect but a high MIC against M. intracellulare clinical isolates

没有一种口服β-内酰胺组合对M. intracellulare标准菌株显示出协同效应。相比之下，51种静脉注射β-内酰胺组合对M. intracellulare标准菌株显示出协同效应。使用25株CLR敏感和4株CLR耐药的M. intracellulare临床分离株，我们计算了已鉴定组合（头孢曲松与多利培南或美罗培南）的MIC₅₀、MIC₉₀值和FIC指数。针对CLR敏感的M. intracellulare，头孢曲松、多利培南和美罗培南单独使用的MIC₅₀和MIC₉₀值均为64/128 μg/mL。当头孢曲松与多利培南或美罗培南联合使用时，头孢曲松的MIC₅₀和MIC₉₀值为16/64 μg/mL，多利培南和美罗培南的为8/32 μg/mL。两种组合的FIC指数为0.31–0.75，表明具有协同或相加效应。CLR耐药M. intracellulare的样本量太小，无法计算统计值，但MIC和FIC指数接近CLR敏感菌株的分布。

DISCUSSION

本研究鉴定出对M. avium（包括CLR耐药菌株）有效的临床可用双重β-内酰胺组合。我们还观察到M. avium和M. intracellulare在双重β-内酰胺组合的影响和MIC分布方面存在显著差异。这些发现表明，在治疗MAC肺病时，确定是由M. avium还是M. intracellulare引起至关重要，以便给予适当的治疗。

据报道，MAC临床分离株不产生β-内酰胺酶。为了证实这一点，我们研究了β-内酰胺酶抑制剂组合是否降低了对MAC标准菌株的β-内酰胺MIC，发现它们保持不变。一些研究报道，阿维巴坦不能增强苯青霉素、头孢曲松和厄他培南对M. avium的活性。我们证实β-内酰胺酶抑制剂不能改善β-内酰胺对MAC的活性。我们还观察到，高浓度的舒巴坦和他唑巴坦（具有β-内酰胺环结构）对M. avium标准菌株显示出抗菌活性。因为舒巴坦通过结合PBP1和PBP3抑制鲍曼不动杆菌的生长，所以舒巴坦和他唑巴坦很可能直接与M. avium的PBPs相互作用。值得注意的是，未观察到对M. intracellulare的此类抗生素活性。

口服β-内酰胺的棋盘法揭示了五种协同对，所有这些组合都包括头孢呋辛或特比培南，针对M. avium ATCC700898。然而，没有一种对M. intracellulare ATCC13950显示出协同效应。与Negatu等人的发现相比，我们研究中观察到的组合效应程度较小，尽管头孢呋辛、特比培南或阿莫西林的组合对M. avium显示出协同效应。这种结果差异可能是由于M. avium菌株或培养基成分的不同。值得注意的是，据报道，分枝杆菌的MIC在使用Middlebrook 7H9肉汤或阳离子调节Mueller-Hinton肉汤（CAMHB）进行肉汤微量稀释时有所不同。对于口服药物对，我们的发现与Negatu等人一致，他们报道对M. intracellulare的组合效应小于对M. avium的组合效应。当静脉注射β-内酰胺联合使用时，观察到对M. avium ATCC700898和M. intracellulare ATCC13950的协同效应。Al-Jabri等人报道，美罗培南与头孢菌素的三种组合对MAC有效，我们的研究也显示了一些碳青霉烯类和头孢菌素的协同对，包括碳青霉烯类与早期头孢菌素对M. avium，以及碳青霉烯类与后期头孢菌素对M. intracellulare。这些结果表明，细胞壁结构和PBP谱在M. avium和M. intracellulare之间存在差异。

组合显示协同效应的机制基于β-内酰胺靶向参与肽聚糖合成的不同PBPs的见解。基于这种机制的双重β-内酰胺疗法的一个例子是氨苄西林和头孢曲松联合使用对抗粪肠球菌的临床应用。PBPs是肽聚糖合成酶。它们分为D,D-转肽酶（Ddts）、L,D-转肽酶（Ldts）和D,D-羧肽酶。Ddts和Ldts分别以茎肽的4′?3′或3′?3′键交联肽聚糖。D,D-羧肽酶对于产生Ldt底物很重要。Ddts被几乎所有β-内酰胺灭活，而Ldt抑制仅限于碳青霉烯类和青霉烯类，以及较小程度的头孢菌素。与细菌中Ddt的普遍优势相比，Ldts在结核分枝杆菌和脓肿分枝杆菌中负责大部分肽聚糖交联。因此，能够灭活Ldts的碳青霉烯类对于克服结核分枝杆菌和脓肿分枝杆菌对β-内酰胺的耐药性非常重要。有必要研究MAC细胞壁肽聚糖中3′?3′键的优势和百分比，以及其他分枝杆菌的情况。MAC基因组编码几种亚类的Ddts、Ldts和D,D-羧肽酶，与结核分枝杆菌和脓肿分枝杆菌的基因组一样。在M. avium中，Ldt_Mav2被法罗培南、特比培南、亚胺培南、多利培南、比阿培南和头孢噻吩抑制，但不被阿莫西林、氨苄西林、头孢西丁或美罗培南抑制。在我们的研究中，特比培南与阿莫西林以及特比培南与法罗培南分别显示出协同和相加效应。因此，组合对M. avium协同的机制可能涉及一种抑制Ldt_Mav2的β-内酰胺，弥补了另一种β-内酰胺对Ldt_Mav2抑制的缺乏。另一方面，头孢呋辛与法罗培南显示出协同效应，但与特比培南显示出相加效应，表明该机制不能仅用Ldt_Mav2抑制来解释。认为多种PBPs在β-内酰胺抗生素对MAC的协同效应以及MAC生存和生长机制中发挥重要作用。然而，由于没有关于其PBPs的研究，很难确定双重β-内酰胺对M. intracellulare的作用机制。我们观察到碳青霉烯类与头孢菌素组合对M. intracellulare的协同效应，表明对M. intracellulare的组合效应是通过抑制多种PBPs实现的，与M. avium类似。此外，尽管通常认为同一家族的β-内酰胺，如青霉素类、头孢菌素类或碳青霉烯类，抑制相同的PBPs，但一项研究报道，同一家族中的每种β-内酰胺与不同的PBPs结合。在我们的研究中，同一家族的组合，如头孢氨苄和头孢呋辛，也显示出协同效应。尚未证明这些β-内酰胺是否抑制相同的PBPs或显示不同的抑制模式。在脓肿分枝杆菌中，尽管靶点重叠，包括Ldt_Mab1、Ldt_Mab2和Ldt_Mab4，但亚胺培南和头孢洛林的组合显示出协同效应。因为亚胺培南对这些靶点的亲和力高于头孢洛林，作者假设亚胺培南首先与靶点结合，改变构象以促进头孢洛林与同一靶点结合。尽管他们能够在计算机上支持这一假设，但它需要活性位点的灵活性。简而言之，为了揭示β-内酰胺组合效应对MAC的作用机制，需要进一步的基础研究来表征MAC的PBP分子，并分析PBPs与每种β-内酰胺之间的结合亲和力和构象。

针对M. avium ATCC700898的口服特比培南和阿莫西林组合具有最低的MIC，分别降至2和0.5 μg/mL。表明这些浓度可以在临床健康成人的上皮衬液（epithelial lining fluid, ELF）中达到或接近达到。特比培南匹酯氢溴酸盐给药（每8小时600毫克，五次剂量）导致ELF浓度为0.824 μg/mL。此外，单剂量阿莫西林（500毫克）给药导致ELF浓度为0.89 μg/mL。考虑到MAC肺病的长期治疗周期（数年），口服药物对门诊患者有利。

β-内酰胺对CLR耐药M. avium的MIC高于CLR敏感菌株。这可能与宿主环境有关。在我们的研究中，CLR耐药菌株曾暴露于几种抗生素，而CLR敏感菌株仅来自医疗记录显示无抗菌治疗指征的患者。MAC肺病的标准治疗药物（CLR、乙胺丁醇、利福平和阿米卡星）诱导各种转运蛋白基因的上调，包括推定的低特异性转运蛋白，表明抗生素外流可能导致CLR耐药菌株的高MIC。然而，CLR耐药M. avium也显示出对β-内酰胺的最低MIC。据我们所知，没有报道表明对一类抗生素耐药的菌株对另一类抗生素的MIC范围比敏感菌株更广。目前尚不清楚这些高度敏感菌株是天然敏感还是在抗生素暴露后获得了这些特征。因此，分析具有不同敏感性的菌株对于理解β-内酰胺耐药机制至关重要。CLR敏感M. avium和CLR耐药M. avium之间的FIC指数没有显著差异，证实了Negatu等人的预测，即β-内酰胺组合有效，与CLR敏感性无关，从而为治疗选择有限的CLR耐药M. avium肺病提供了有希望的治疗选择。

尽管β-内酰胺的MIC分布倾向于在M. intracellulare中高于M. avium，但测试的β-内酰胺不同。然而，这种差异可能是由物种间的生物学变异引起的。由于CLR敏感MAC菌株专门来自未治疗病例，因此不太可能存在先前抗生素暴露的偏差。一种可能的解释是，β-内酰胺对MAC的敏感性在物种间存在显著差异，M. intracellulare倾向于耐药。这种趋势得到了一份韩国报告的支持，该报告显示，对NTM（包括亚胺培南和头孢西丁）的抗菌剂MIC分布在M. intracellulare中显著高于M. avium。

由于尚未定义针对MAC的β-内酰胺折点，因此无法确定β-内酰胺单独使用和联合使用的敏感性。此外，尚未研究β-内酰胺对MAC的体外敏感性与临床反应之间的相关性。因此，需要进一步的体内研究和临床试验来分析β-内酰胺的MIC与临床结果之间的关系。由于我们检查的大多数药物已被批准，预计临床试验将很快开始。尽管特比培南在日本仅批准用于儿童，但口服特比培南在成人中的III期试验正在进行中，以治疗复杂性尿路感染和急性肾盂肾炎。在肺部感染中，抗生素在ELF或肺泡巨噬细胞中的浓度可能反映肺炎的抗菌活性。如上所述，单剂量阿莫西林（500毫克）和特比培南匹酯氢溴酸盐给药（每8小时600毫克，五次剂量）分别导致ELF浓度为0.89和0.824 μg/mL。这些药物剂量也分别导致血清浓度为6.9 μg/mL和血浆浓度为8.09 μg/mL。单剂量头孢呋辛（500毫克）导致ELF浓度为0.7 μg/mL，血清浓度为3.9 μg/mL。口服β-内酰胺对ELF的渗透率通常报告为总血浆浓度的0.12–0.38。尽管缺乏肺药代动力学数据，但据报道，单剂量头孢氨苄（500毫克）和法罗培南给药（每天三次300毫克，持续5天）在健康成人中分别导致血浆浓度为21.29和5.7 μg/mL。考虑到这些血浆浓度，如果肺渗透尽可能高，则头孢氨苄和法罗培南预计在ELF中分别达到2.6–8.1和0.68–2.2 μg/mL。我们研究中β-内酰胺对M. avium临床菌株的MIC高于这些估计的ELF浓度。尽管在MAC肺病患者中的药代动力学及其MIC与临床反应之间的相关性尚不清楚，但应在肺部维持更高的浓度以实现临床治愈。提高局部浓度的一个想法是修改药物递送系统。与β-内酰胺类似，阿米卡星是亲水性的。因此，与静脉注射相比，当将其包裹在脂质体中并吸入时，肺泡巨噬细胞内的细胞内摄取增加了274倍。

这项研究有一些局限性。首先，临床分离株是从单一医院收集的。因此，我们的发现必须在多中心研究中对大量具有各种临床背景和来自不同地理环境的MAC菌株进行确认。其次，我们没有充分评估对CLR耐药M. intracellulare的抗菌活性和组合效应，因为与M. intracellulare相比，M. avium在收集地点占主导地位。需要进一步评估更多CLR耐药的M. intracellulare菌株。第三，由于在微量稀释棋盘法测定中使用的肉汤中测试药物的不稳定性，抗菌活性可能被低估。碳青霉烯类在溶液中容易退化，因此它们的浓度可能无法在整个测定过程中维持。必须应用不同的评估系统来准确评估效果。

总之，β-内酰胺的组合效应及其抗菌活性在M. avium和M. intracellulare之间存在差异。法罗培南与头孢呋辛的组合显示出最高的协同效应，而阿莫西林与特比培南的组合对M. avium显示出最低的MIC。这些组合在CLR敏感和CLR耐药M. avium之间的效果没有显著差异。口服β-内酰胺组合对M. avium有效，而双重β-内酰胺组合对M. intracellulare无效。

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains

标准菌株M. avium Chester ATCC700898和M. intracellulare ATCC13950购自Brigham and Women’s Hospital（波士顿，美国）。临床MAC分离株（n=85），包括56株M. avium和29株M. intracellulare，是从2014年至2021年在庆应义塾大学医院（东京，日本）患者呼吸道标本中培养的。所有菌株在Middlebrook 7H11琼脂平板上于37°C、5% CO₂下培养约3周。从所得菌落中分离的细菌悬浮在含有10%（体积/体积）Middlebrook OADC Enrichment、0.2%甘油和0.05% Tween 80的Middlebrook 7H9肉汤中。悬浮液分装到冷冻管中，并在?80°C下储存。

Antib